化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence analysis,CLIA)誕生于1977年。根據(jù)放射免疫分析的基本原理,，將高靈敏的化學(xué)發(fā)光技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合起來(lái),，建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析法。CLIA具有靈敏度高,、特異性強(qiáng),、線性范圍寬、操作簡(jiǎn)便,、不需要十分昂貴的儀器設(shè)備等特點(diǎn),。CLIA應(yīng)用范圍較廣，既可檢測(cè)不同分子大小的抗原,、半抗原和抗體,，又可用于核酸探針的檢測(cè)。CLIA與放射免疫分析(RIA),、熒光免疫分析(IFA)及酶免疫分析(EIA)相比,，具有無(wú)輻射,、標(biāo)記物有效期長(zhǎng)并可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。CLIA為獸醫(yī),、醫(yī)學(xué)及食品分析檢測(cè)和科學(xué)研究提供了一種痕量或超痕量的非同位素免疫檢測(cè)手段,。

1．化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的基本原理

化學(xué)發(fā)光免疫分析含有免疫分析和化學(xué)發(fā)光分析兩個(gè)系統(tǒng)。免疫分析系統(tǒng)是將化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或酶作為標(biāo)記物,，直接標(biāo)記在抗原或抗體上,，經(jīng)過(guò)抗原與抗體反應(yīng)形成抗原一抗體免疫復(fù)合物?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是在免疫反應(yīng)結(jié)束后,，加入氧化劑或酶的發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)氧化劑的氧化后,，形成一個(gè)處于激發(fā)態(tài)的中間體,，會(huì)發(fā)射光子釋放能量以回到穩(wěn)定的基態(tài)，發(fā)光強(qiáng)度可以利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器進(jìn)行檢測(cè),。根據(jù)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系,，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測(cè)物的含量。

2．化學(xué)發(fā)光免疫分析法的類型

化學(xué)發(fā)光免疫分析法根據(jù)標(biāo)記物的不同可分為三大類,，即化學(xué)發(fā)光免疫分析,、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法。

2.1 化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原的一類免疫測(cè)定方法,。目前常見(jiàn)的標(biāo)記物主要為魯米諾類和吖啶酯類化學(xué)發(fā)光劑,。

2.1.1 魯米諾類標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析：魯米諾類物質(zhì)的發(fā)光為氧化反應(yīng)發(fā)光。在堿性溶液中,，魯米諾可被許多氧化劑氧化發(fā)光,，其中H2o2最為常用。因發(fā)光反應(yīng)速度較慢,，需添加某些酶類或無(wú)機(jī)催化劑,。酶類主要是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，無(wú)機(jī)類包括O3,、鹵素及Fe3 ,、Cu2 、Co2 和它們的配合物,。早期主要用于無(wú)機(jī)物和有機(jī)生物小分子的測(cè)定,，靈敏度因標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度降低而降低。人們發(fā)現(xiàn)發(fā)光體系中加入某些酚類及其衍生物,、胺類及其衍生物和苯基硼酸衍生物對(duì)體系的發(fā)光均有顯著增強(qiáng)作用,，發(fā)光強(qiáng)度可提高1000倍，并且“本底”發(fā)光顯著降低,，發(fā)光時(shí)間也得到延長(zhǎng),。這些增強(qiáng)劑的使用,，使化學(xué)發(fā)光免疫分析在蛋白、核酸分析領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,。

2.1.2 吖啶酯類標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析：吖啶酯用于CLIA由于熱穩(wěn)定性不是很好,，經(jīng)研究合成了更穩(wěn)定的吖啶酯衍生物。在H2o2和OH一條件下,，吖啶酯類化合物能迅速發(fā)光,，量子產(chǎn)率很高，如吖啶芳香酯的量子產(chǎn)率可達(dá)0.05,，吖啶酯作為標(biāo)記物用于免疫分析,，發(fā)光體系簡(jiǎn)單、快速,，不需要加入催化劑,，且標(biāo)記效率高，本底低,。這些特點(diǎn)引起廣大分析診斷工作者的極大興趣,。

2．2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(Chemiluminescent enzymeimmunoassay，cLEIA)屬酶免疫分析,，只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免分析完全相同：以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng),，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物,，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定,。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP )和堿性磷酸酶(ALP),，它們有各自的發(fā)光底物。HRP最常用發(fā)光底物是魯米諾及其衍生物,。在CLEIA中,，使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，進(jìn)行免疫反應(yīng)后,，利用魯米諾作為發(fā)光底物,，在過(guò)氧化物酶和起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH和H2o2)作用下魯米諾發(fā)光，酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度決定了化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度,。此傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光體系(HRP-H2O2-LUMINOL)為幾秒內(nèi)瞬時(shí)閃光,，存在發(fā)光強(qiáng)度低、不易測(cè)量等缺點(diǎn),。后來(lái),，在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強(qiáng)發(fā)光劑，以增強(qiáng)發(fā)光信號(hào),，并在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定,，便于重復(fù)測(cè)量,，從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。

堿性磷酸酶(ALP)已廣泛用于酶聯(lián)免疫分析和核酸雜交分析,。堿性磷酸酶和1,，2．二氧環(huán)乙烷構(gòu)成的發(fā)光體系是目前最重要、最靈敏的一類化學(xué)發(fā)光體系,。這類體系中具有代表性的是ALP-AMPPD發(fā)光體系,。在溶液中AMPPD的磷酸酯鍵很穩(wěn)定，非酶催化的水解非常慢,，在pHl2的0.05 mol／L碳酸鈉緩沖溶液中,，分解半衰期可達(dá)74年，幾乎沒(méi)有試劑本身的發(fā)光背景,。AMPPD為磷酸酯酶的直接發(fā)光底物,，可用來(lái)檢測(cè)堿性磷酸酶或抗體、核酸探針及其他配基的結(jié)合物,。ALP-AMPPD發(fā)光體系具有非常高的靈敏度,，對(duì)標(biāo)記物ALP的檢測(cè)限達(dá)10-21 mol，是最靈敏的免疫測(cè)定方法之一,。對(duì)AMPPD加以改進(jìn),，獲得具有更好反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和更高

靈敏度的新一代產(chǎn)物：CSPD、CDP-Star,。這些體系已廣泛用于各種基因,、病原體DNA的鑒定。

2．3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析

電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Electrochemiluminescence,，ECL)是指由電化學(xué)反應(yīng)引起的化學(xué)發(fā)光過(guò)程,。ECL的反應(yīng)在電極表面進(jìn)行，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕[Ru(byp)2+3 ],，三丙胺(TPA)用來(lái)激發(fā)光反應(yīng),。在陽(yáng)極表面，兩種物質(zhì)同時(shí)失去電子,。在電極板上Ru(byp)2+3 被氧化成Ru(byp)3+3,TPA也被氧化成陽(yáng)離子自由基(TPA+# ),，TPA+#自發(fā)地釋放一個(gè)質(zhì)子而變成非穩(wěn)定分子(TPA* )，將一個(gè)電子遞給Ru(byp)3+3,，形成激發(fā)態(tài)的Ru(byp)2+3,。Ru(byp)3+3在衰減的同時(shí)發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)為620NM的光子，重新回到基態(tài)Ru(byp)2+3,。這一過(guò)程在電極表面反復(fù)進(jìn)行,，產(chǎn)生高效、穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光，并不斷增強(qiáng),。

ECL的突出優(yōu)點(diǎn)是：①標(biāo)記分子小,，可實(shí)現(xiàn)多標(biāo)記，標(biāo)記物非常穩(wěn)定,；②發(fā)光時(shí)間長(zhǎng),，靈敏度高；③光信號(hào)線性好,，動(dòng)力學(xué)范圍寬,，超過(guò)6個(gè)數(shù)量級(jí)；④可重復(fù)測(cè)量,，重現(xiàn)性好,；⑤可實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)和均相免疫分析；⑥快速,，完成一個(gè)樣品的分析通常只需18 min,；⑦可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化。由于電化學(xué)發(fā)光免疫分析具有優(yōu)越性,，是一種很有發(fā)展前途的免疫分析法,，日益受到人們的重視，目前已廣泛應(yīng)用于抗原,、半抗原及抗體的免疫檢測(cè),。