化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence analysis,CLIA)誕生于1977年。根據(jù)放射免疫分析的基本原理，將高靈敏的化學(xué)發(fā)光技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合起來,，建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析法,。CLIA具有靈敏度高,、特異性強,、線性范圍寬、操作簡便,、不需要十分昂貴的儀器設(shè)備等特點,。CLIA應(yīng)用范圍較廣，既可檢測不同分子大小的抗原,、半抗原和抗體,，又可用于核酸探針的檢測。CLIA與放射免疫分析(RIA),、熒光免疫分析(IFA)及酶免疫分析(EIA)相比,，具有無輻射、標記物有效期長并可實現(xiàn)全自動化等優(yōu)點,。CLIA為獸醫(yī),、醫(yī)學(xué)及食品分析檢測和科學(xué)研究提供了一種痕量或超痕量的非同位素免疫檢測手段。
1．化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的基本原理
化學(xué)發(fā)光免疫分析含有免疫分析和化學(xué)發(fā)光分析兩個系統(tǒng),。免疫分析系統(tǒng)是將化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或酶作為標記物,，直接標記在抗原或抗體上，經(jīng)過抗原與抗體反應(yīng)形成抗原一抗體免疫復(fù)合物,?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是在免疫反應(yīng)結(jié)束后,，加入氧化劑或酶的發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)氧化劑的氧化后,，形成一個處于激發(fā)態(tài)的中間體,，會發(fā)射光子釋放能量以回到穩(wěn)定的基態(tài)，發(fā)光強度可以利用發(fā)光信號測量儀器進行檢測,。根據(jù)化學(xué)發(fā)光標記物與發(fā)光強度的關(guān)系,，可利用標準曲線計算出被測物的含量。
2．化學(xué)發(fā)光免疫分析法的類型
化學(xué)發(fā)光免疫分析法根據(jù)標記物的不同可分為三大類,，即化學(xué)發(fā)光免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析
和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,。
2.1 化學(xué)發(fā)光免疫分析
化學(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光劑直接標記抗體或抗原的一類免疫測定方法,。目前常見的標記物主要為魯米諾類和吖啶酯類化學(xué)發(fā)光劑。
2.1.1 魯米諾類標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析：魯米諾類物質(zhì)的發(fā)光為氧化反應(yīng)發(fā)光,。在堿性溶液中,，魯米諾可被許多氧化劑氧化發(fā)光，其中H2o2最為常用,。因發(fā)光反應(yīng)速度較慢,，需添加某些酶類或無機催化劑。酶類主要是辣根過氧化物酶(HRP),，無機類包括O3,、鹵素及Fe3 、Cu2 ,、Co2 和它們的配合物,。早期主要用于無機物和有機生物小分子的測定，靈敏度因標記后發(fā)光強度降低而降低,。人們發(fā)現(xiàn)發(fā)光體系中加入某些酚類及其衍生物,、胺類及其衍生物和苯基硼酸衍生物對體系的發(fā)光均有顯著增強作用，發(fā)光強度可提高1000倍,，并且“本底”發(fā)光顯著降低,，發(fā)光時間也得到延長。這些增強劑的使用,，使化學(xué)發(fā)光免疫分析在蛋白,、核酸分析領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
2.1.2 吖啶酯類標記的化學(xué)發(fā)光免疫分析：吖啶酯用于CLIA由于熱穩(wěn)定性不是很好,，經(jīng)研究合成了更穩(wěn)定的吖啶酯衍生物,。在H2o2和OH一條件下，吖啶酯類化合物能迅速發(fā)光,，量子產(chǎn)率很高,，如吖啶芳香酯的量子產(chǎn)率可達0.05,，吖啶酯作為標記物用于免疫分析，發(fā)光體系簡單,、快速,，不需要加入催化劑，且標記效率高,，本底低,。這些特點引起廣大分析診斷工作者的極大興趣。
2．2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析
化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(Chemiluminescent enzymeimmunoassay,，cLEIA)屬酶免疫分析,，只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免分析完全相同：以酶標記生物活性物質(zhì)進行免疫反應(yīng),，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物,，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定,。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP )和堿性磷酸酶(ALP),，它們有各自的發(fā)光底物。HRP最常用發(fā)光底物是魯米諾及其衍生物,。在CLEIA中,，使用過氧化物酶標記抗體，進行免疫反應(yīng)后,，利用魯米諾作為發(fā)光底物,，在過氧化物酶和起動發(fā)光試劑(NaOH和H2o2)作用下魯米諾發(fā)光，酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度決定了化學(xué)發(fā)光的強度,。此傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光體系(HRP-H2O2-LUMINOL)為幾秒內(nèi)瞬時閃光,，存在發(fā)光強度低、不易測量等缺點,。后來,，在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強發(fā)光劑，以增強發(fā)光信號,，并在較長的時間內(nèi)保持穩(wěn)定,，便于重復(fù)測量，從而提高分析靈敏度和準確性,。
堿性磷酸酶(ALP)已廣泛用于酶聯(lián)免疫分析和核酸雜交分析,。堿性磷酸酶和1，2．二氧環(huán)乙烷構(gòu)成的發(fā)光體系是目前最重要,、最靈敏的一類化學(xué)發(fā)光體系,。這類體系中具有代表性的是ALP-AMPPD發(fā)光體系。在溶液中AMPPD的磷酸酯鍵很穩(wěn)定,，非酶催化的水解非常慢,，在pHl2的0.05 mol／L碳酸鈉緩沖溶液中,，分解半衰期可達74年，幾乎沒有試劑本身的發(fā)光背景,。AMPPD為磷酸酯酶的直接發(fā)光底物,，可用來檢測堿性磷酸酶或抗體、核酸探針及其他配基的結(jié)合物,。ALP-AMPPD發(fā)光體系具有非常高的靈敏度,，對標記物ALP的檢測限達10-21 mol，是最靈敏的免疫測定方法之一,。對AMPPD加以改進,，獲得具有更好反應(yīng)動力學(xué)和更高
靈敏度的新一代產(chǎn)物：CSPD、CDP-Star,。這些體系已廣泛用于各種基因,、病原體DNA的鑒定。
2．3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析
電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Electrochemiluminescence,，ECL)是指由電化學(xué)反應(yīng)引起的化學(xué)發(fā)光過程。ECL的反應(yīng)在電極表面進行,，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕[Ru(byp)2+3 ],，三丙胺(TPA)用來激發(fā)光反應(yīng)。在陽極表面,，兩種物質(zhì)同時失去電子,。在電極板上Ru(byp)2+3 被氧化成Ru(byp)3+3,TPA也被氧化成陽離子自由基(TPA+# )，TPA+#自發(fā)地釋放一個質(zhì)子而變成非穩(wěn)定分子(TPA* ),，將一個電子遞給Ru(byp)3+3,，形成激發(fā)態(tài)的Ru(byp)2+3。Ru(byp)3+3在衰減的同時發(fā)射一個波長為620NM的光子,，重新回到基態(tài)Ru(byp)2+3,。這一過程在電極表面反復(fù)進行，產(chǎn)生高效,、穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光,，并不斷增強。
ECL的突出優(yōu)點是：①標記分子小,，可實現(xiàn)多標記,，標記物非常穩(wěn)定；②發(fā)光時間長,，靈敏度高,；③光信號線性好，動力學(xué)范圍寬,，超過6個數(shù)量級,；④可重復(fù)測量,，重現(xiàn)性好；⑤可實現(xiàn)多元檢測和均相免疫分析,；⑥快速,，完成一個樣品的分析通常只需18 min；⑦可實現(xiàn)全自動化,。由于電化學(xué)發(fā)光免疫分析具有優(yōu)越性,，是一種很有發(fā)展前途的免疫分析法，日益受到人們的重視,，目前已廣泛應(yīng)用于抗原,、半抗原及抗體的免疫檢測。
