生物谷報(bào)道：造紙工業(yè)的迅速發(fā)展造成了嚴(yán)重環(huán)境污染,，利用生物處理技術(shù)來(lái)降解污染物是制漿造紙廢水中的最重要的方法之一，但目前的研究主要幾種在處理工藝的選擇及工藝參數(shù)的和設(shè)計(jì)參數(shù)的優(yōu)化,，面對(duì)其中微生物的研究涉及很少,。但生物處理系統(tǒng)中微生物的種群結(jié)構(gòu)以及微生物多樣性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能穩(wěn)定性在污水處理系統(tǒng)有效性中起著重要作用,。研究水處理工藝中微生物的組成結(jié)構(gòu),、數(shù)量以及多樣性對(duì)于提高廢水生物處理效果,，研究生化反應(yīng)的機(jī)理，,、污染物降解和轉(zhuǎn)化途徑具有非常重要的意義,。但是傳統(tǒng)的微生物法用于環(huán)境生物學(xué)研究時(shí)環(huán)境中只有不超過(guò)10%的微生物可以培養(yǎng)，并且由于常規(guī)檢測(cè)方法受到采樣和分析條件的影響,，不僅檢測(cè)時(shí)間廠,，結(jié)果準(zhǔn)確率差，而且有些種類分離比較困難,。因此,，傳統(tǒng)的方法不能充分揭示微生物群落多樣性的變化來(lái)迅速判斷環(huán)境的變化。
近年來(lái),，分子生物學(xué)的迅速發(fā)展使得微生物不需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的分離培養(yǎng),，而直接從樣品里提取DNA來(lái)對(duì)復(fù)雜微生物生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行研究，能夠快速反應(yīng)生物學(xué)方法具有簡(jiǎn)便,、快速,、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛采用,，主要的方法有核酸探針雜交檢測(cè)方法,、熒光原位雜交（FISH）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）,、變性梯度凝膠電泳（DGGE）和脂肪酸指紋法等,。將PCR-DGGE結(jié)合起來(lái)可以使我們能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定微生物個(gè)體,，并進(jìn)行復(fù)雜微生物的群落多樣性和動(dòng)態(tài)性,、特殊基因的跟蹤與表達(dá)的分析，尤其適合對(duì)不同的研究對(duì)或者不同時(shí)空的某一對(duì)象內(nèi)微生物的組成分析,，已被廣泛應(yīng)用于生物,、環(huán)境、食品,、醫(yī)藥等微生物的檢測(cè)中,，但是在制漿造紙廢水處理微生物的檢測(cè)中的應(yīng)用在國(guó)內(nèi)還鮮見(jiàn)報(bào)道，將其應(yīng)用于制漿造紙廢水處理的微生物檢測(cè)中有助于理解微生物的作用機(jī)理,，對(duì)制漿造紙廢水的處理具有非常重要的意義,。
1 PCR-DGGE的發(fā)展
20世紀(jì)70年代初，Kteppe等就提出了PCR的工作原理,。1985年Cetus公司的Mullis等建立了一套大量快速擴(kuò)增特異DNA片段的系統(tǒng),，獲得了大量染色體DNA單拷貝基因，但是使用的大腸桿菌DNA聚合酶Klenow不耐熱。1988年,，Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌中提取到耐熱的TaqDNA多聚酶,，并引入了PCR系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TaqDNA聚合酶經(jīng)過(guò)多次循環(huán)后仍具有活性,，反應(yīng)體系可以自動(dòng)往復(fù)多次循環(huán)后仍具有活性,，反應(yīng)體系可以自動(dòng)往復(fù)多次的對(duì)所需DNA片段進(jìn)行酶促合成。1993年,，Mullis采用定向酶促擴(kuò)增法選擇性的富集某一特異性DNA序更10的六次方倍,，可以從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到一個(gè)靶細(xì)胞。自此,，PCR技術(shù)就開(kāi)始就開(kāi)始在各個(gè)相關(guān)領(lǐng)域得到了迅速而廣泛的應(yīng)用,。
DGGE是由Fischer和Lerman最先提出的用于檢測(cè)點(diǎn)突變的一種電泳技術(shù)，1985年,，Myers等首次采用“GC夾板”技術(shù)并使用異源雙鏈技術(shù),，Sheffield等于1989年將“GC夾板”技術(shù)與PCR技術(shù)相連接，1993年Muyzer首次將其引入分子微生物學(xué)的研究中,。目前PCR-DGGE已經(jīng)成為一項(xiàng)常規(guī)的分子生物學(xué)研究方法,，在微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析上有廣泛的應(yīng)用。
2 PCR-DGGE的原理和特點(diǎn)
PCR是一種體外酶促擴(kuò)增特異DNA序列的技術(shù),，是利用針對(duì)目的基因所設(shè)計(jì)的一對(duì)特異寡核苷酸引物,，以目的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行的DNA體外合成反應(yīng)。PCR反應(yīng)包括模板DNA鏈的熱變形,、引物退火復(fù)性和在DNA聚合酶作用下引物的延伸三個(gè)階段,。模板DNA加熱到94攝氏度左右反雙鏈解離成單鏈，在一定的溫度下,，兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物分別與模板DNA的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合,，結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，按照堿基配對(duì)與半保留復(fù)制的原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的鏈,。由于反應(yīng)循環(huán)可以進(jìn)行一定次數(shù)（通常為25-30個(gè)循環(huán)）,，所以在短時(shí)間內(nèi)就可以獲得大量目的基因,。
DGGE可分離長(zhǎng)度相同但是堿基不同的DNA片段的混合物，DGGE膠在聚丙烯酰胺膠中添加了線性梯度的變性劑甲酰胺,。,，這樣就可以形成從低到高的線性梯度。通常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢驗(yàn)PCR的結(jié)果,。將PCR和DGGE結(jié)合起來(lái)在變性條件適當(dāng)?shù)那闆r下能分辨一個(gè)堿基對(duì),，分辨率較高。染色后的凝膠用成像系統(tǒng)分析可以在一定成都上反應(yīng)樣品的復(fù)雜性,。條帶的多少能反應(yīng)樣品中微生物組成的差異,，條帶的亮度能反應(yīng)樣品中微生物的多少,。由于PCR-DGGE具有以上優(yōu)點(diǎn)，目前該技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu)的分析和動(dòng)態(tài)研究方面得到了廣泛應(yīng)用,。
3 PCR-DGGE在環(huán)境微生物檢測(cè)中的應(yīng)用
制漿造紙廢水中含有大量的糖類,、木素等有機(jī)化合物，通常采用活性污泥法來(lái)降解污染物,，將PCR-DGGE用于活性污泥中微生物的研究已經(jīng)有很多報(bào)道,。Marsh等利用PCR-DGGE分析并獲得了油菜花活性污泥中真核生物的種群變化情況，王峰等采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)城市污水化學(xué)生物的絮凝處理中活性污泥和生物膜中微生物種群驚醒了分析,，結(jié)果表明活性污泥培養(yǎng)前后微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化,。
制漿含氯漂白的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種有機(jī)氯化物，尤其是產(chǎn)生的氯代酚類具有很強(qiáng)的毒性,、致癌,、致畸、致突變性,，很難生物降解,，因此篩選出降解這些物質(zhì)的優(yōu)勢(shì)菌并理解他們的作用機(jī)理具有非常重要的意義。任艷紅等采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)降解五氯酚的厭氧生物反應(yīng)器中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,，結(jié)果表明隨著PCR負(fù)荷的與污泥的顆?；勰嗾婕?xì)菌和古細(xì)菌組成都發(fā)生了變化,。
PCR-DGGE不僅僅用于廢水活性污泥中微生物的檢測(cè),，在土壤和其他方面也有廣泛應(yīng)用。Mphekgo p.Maila等研究了地理未知和碳?xì)浠衔镂廴緝煞N因素對(duì)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能的影響,，結(jié)果顯示污染物對(duì)微生物造成的影響更大,。趙璇等研究了被氯酚污染的土壤中微生物群落的變化，發(fā)現(xiàn)未受氯酚污染和受氯酚污染的土壤中有共同的DNA譜帶,，但強(qiáng)度有顯著差異,。
此外，PCR-DGGE還可以用于檢測(cè)細(xì)菌和跟蹤某些細(xì)菌的基因,。Nicolaisen等利用PCR-DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)Nitrosomonas-like細(xì)菌是商流式好氧流化床顆粒污泥中的主要氨氧化菌,。劉新春等應(yīng)用PCR-DGGE方法，對(duì)在相同的操作條件下分別用低溫菌和常溫菌家中的兩套活性污泥系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了追蹤,。
4 PCR-DGGE技術(shù)的發(fā)展前景
由于PCR-DGGE技術(shù)無(wú)需長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng),，準(zhǔn)確率高，快速簡(jiǎn)便,，能克服傳統(tǒng)方法分析微生物群落的限制,，目前已經(jīng)成為微生物分析技術(shù)的一種重要手段。但是PCR-DGGE存在可分析的樣品容量小、不能對(duì)樣品中所有的DNA片段進(jìn)行分離等局限性,，為了充分全面的揭示微生物的群落結(jié)構(gòu),，往往將DGGE與其他技術(shù)結(jié)合起來(lái)進(jìn)行分析。將PCR-DGGE與其他分子生物學(xué)技術(shù)以及微生物學(xué)方法結(jié)合起來(lái)可以減少不同技術(shù)的弊端和局限性,，綜合各種技術(shù)的優(yōu)勢(shì),，可以更準(zhǔn)確的揭示微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。將PCR-DGGE與其他技術(shù)聯(lián)合起來(lái),，用于制漿造紙廢水生物處理系統(tǒng)中微生物群落的分析,，，對(duì)于揭示微生物降解污染物的機(jī)理有指導(dǎo)意義,，并具有良好的應(yīng)用前景,。（引自財(cái)富紙業(yè)）
