溶菌酶(lysozyme,,ec3.2.1.17)又稱細(xì)胞壁質(zhì)酶(muramidase)或n-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶(n-acetylmuramideglycanohydralase),。1922年英國(guó)細(xì)菌學(xué)家a.fleming發(fā)現(xiàn)人的唾液、眼淚中存在有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶,,因其具有溶菌作用,,故命名為溶菌酶。此后在人和動(dòng)物的多種組織,、分泌液及某些植物,、微生物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在。隨著研究的不斷深入,,發(fā)現(xiàn)不僅有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的溶菌酶,,還有作用于真菌細(xì)胞壁的種類,同時(shí)對(duì)其作用機(jī)制也有了更進(jìn)一步的了解,。近幾年,,人們根據(jù)溶菌酶的溶菌特性,將其應(yīng)用于醫(yī)療,、食品防腐,、畜牧及生物工程中,具有一定的應(yīng)用價(jià)值,。
溶菌酶按其所作用的微生物不同分兩大類,,即細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶和真菌細(xì)胞壁溶菌酶,。細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶有兩種,一種是作用于β-1,,4糖苷鍵的細(xì)胞壁溶解酶,,另一種是作用于肽“尾”和酰胺部分的細(xì)胞壁溶解酶。真菌細(xì)胞壁溶菌酶包括酵母菌細(xì)胞壁溶解酶和霉菌細(xì)胞壁溶解酶,。
溶菌酶廣泛地分布于自然界中,,在人的組織及分泌物中可以找到,動(dòng)物組織中也有,,以雞蛋清中含量最多,。其它植物組織及微生物細(xì)胞中也存在。根據(jù)來(lái)源不同,,其性質(zhì)及作用機(jī)制略有差異,。
雞蛋清溶菌酶占蛋清總蛋白的3.4%~3.5%,作為溶菌酶類的典型代表,,是目前重點(diǎn)研究的對(duì)象,,也是了解最清楚的溶菌酶之一。它由18種129個(gè)氨基酸殘基組成,,具有4個(gè)s-s鍵,,分子量為14000,等電點(diǎn)為11.1,,最適溫度為50℃,,最適ph值為6~7,其化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定,,在ph1.2~11.3范圍內(nèi)劇烈變化時(shí),,結(jié)構(gòu)仍穩(wěn)定不變,。遇熱也很穩(wěn)定,,在ph4~7、100℃處理1min不失活,,是一種穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì),,但在堿性條件下對(duì)熱穩(wěn)定性較差。
其它鳥類如鵪鶉,、珍珠雞,、火雞等的蛋清中也分離純化出溶菌酶,與雞蛋清溶菌酶活性非常相似,,也由129個(gè)氨基酸組成,,雖排列順序有所不同,但活性部位的氨基酸排列則大體相同,。
人溶菌酶存在于眼淚,、唾液,、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺,、白血球,、肝、腎,、淋巴組織中,,1ml眼淚中含7mg溶菌酶,1ml乳汁中含0.1~0.5mg,。人溶菌酶由130個(gè)氨基酸殘基組成,,有4個(gè)s-s鍵,分子量為14600,,其溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高3倍,。
對(duì)于哺乳動(dòng)物溶菌酶,目前已從牛,、豬,、貓、兔,、猴,、馬、羊等動(dòng)物的乳汁中分離出溶菌酶,,其化學(xué)性質(zhì)與人溶菌酶相似,,但結(jié)構(gòu)尚不清楚,其溶菌活性也遠(yuǎn)低于人溶菌酶約3000倍,。曾林(1999)采用瓊脂平板法測(cè)定家兔初乳溶菌酶含量,。結(jié)果表明:初乳溶菌酶含量為(7.96±2.01)μg/ml,常乳溶菌酶含量(5.01±1.32)μg/ml,。人及哺乳動(dòng)物溶菌酶的作用機(jī)制與雞蛋清溶菌酶相同,。
目前已從木瓜、無(wú)花果,、蕪菁,、大麥等植物中分離出溶菌酶,其分子量較大,,約為24000~29100,。植物溶菌酶對(duì)溶壁小球菌的溶菌活性不超過(guò)雞蛋清溶菌酶的1/3,但對(duì)膠體狀甲殼質(zhì)的分解活性則是雞蛋清溶菌酶的10倍,。周澤文(1994)從菜心分離溶菌酶表明,,酶比活力達(dá)3414.6u/mg,純化倍數(shù)為197.4,。菜心溶菌酶在較寬的溫度和ph植范圍內(nèi)均有活性,,最適溫度為60℃,,最適ph值為5.8。高向陽(yáng)(1997)研究了蘿卜溶菌酶對(duì)白色葡萄球菌,、金黃色葡萄球菌,、枯草桿3種革蘭氏陽(yáng)性菌和變形菌、大腸桿菌,、鼠傷寒沙門氏桿菌,、多殺巴斯德氏桿菌、雛白痢沙門氏菌,、產(chǎn)氣桿菌6種革蘭氏陰性菌及釀酒酵母,、總狀毛霉、黑根霉,、黑曲霉,、青霉5種真菌的抑菌效果。同時(shí)還研究了蘿卜溶菌酶對(duì)白菜軟腐病菌,、柑橘潰瘍病菌,、番茄青枯病菌、水稻細(xì)條病菌,、水稻白葉枯病菌及煙草青枯病菌6種植物病原細(xì)菌的抑菌效果,。試驗(yàn)證明:蘿卜溶菌酶對(duì)上述參試的菌種都有不同程度的抑菌作用。
目前微生物產(chǎn)生的溶菌酶分為7類:①內(nèi)n-乙酰已糖胺酶,,此酶同于雞蛋清溶菌酶,,破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵,;②酰胺酶,,切斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中nam與肽“尾”之間的n-乙酰胞壁酸-l-丙氨酸鍵;③內(nèi)肽酶,,使肽“尾”及肽“橋”內(nèi)的肽鍵斷裂,;④β-1,3,、β-1,,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶,此酶分解酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁,;⑤殼多糖酶,與葡聚糖酶共同作用,,可分解霉菌和酵母,;⑥磷酸甘露糖酶,與葡甘露糖酶共同作用,,可分解原生質(zhì),;⑦脫乙酰殼多糖酶,,主要分解毛霉和根霉。
該酶是一種特異性的酶,,由噬菌體感染,、誘導(dǎo)產(chǎn)生,但未被感染的宿主細(xì)胞上不存在該酶,。
溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性水解酶,,此類粘多糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分之一,該酶能催化水解細(xì)胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1,,4糖苷鍵,,使細(xì)胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽,細(xì)菌內(nèi)容物逸出而使細(xì)胞壁溶解,。溶菌酶能直接水解革蘭氏陽(yáng)性菌,,在分泌型免疫球蛋白a、補(bǔ)體的參與下,,還能水解革蘭氏陰性菌如大腸桿菌等,。此外,它還可與各種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)結(jié)合,,使其失活,,并能增強(qiáng)抗生素和其它藥物的療效,改善組織基質(zhì)的粘多糖代謝,,從而達(dá)到消炎,、修復(fù)組織的目的。
梁愛華(2001)考察在不同溫度下雞蛋清溶菌酶與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)及內(nèi)毒素釋放的影響,。結(jié)果:在不同的培養(yǎng)溫度下,,氨芐西林或頭孢噻肟50μg/ml均可導(dǎo)致細(xì)菌溶解,并誘導(dǎo)escherichiacoli釋放大量的內(nèi)毒素到培養(yǎng)上清液中,,這些培養(yǎng)上清液在體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞上可誘導(dǎo)大量的腫瘤壞死因子(tnfα)和白細(xì)胞介素6(il-6)產(chǎn)生,。而雞蛋清溶菌酶與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用能阻止細(xì)菌溶解,降低細(xì)菌內(nèi)毒素的釋放,,并減少巨噬細(xì)胞tnf-和il-6的產(chǎn)生,。
溶菌酶能與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接作用,與dna,、rna,、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽,使病毒失活,。該酶也可以預(yù)防和治療病毒性肝炎,,尤其對(duì)輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。在機(jī)體內(nèi)它還有抗流感病毒的活性,其與膽酸鹽的復(fù)合物能強(qiáng)烈抑制流感病毒和腺病毒的生長(zhǎng),,并能防止皰疹性病毒感染,。
溶菌酶作為機(jī)體非特異免疫因子之一,參與機(jī)體多種免疫反應(yīng),,在機(jī)體正常防御功能和非特異免疫中,,具有保持機(jī)體生理平衡的重要作用??筛纳坪驮鰪?qiáng)巨嗜細(xì)胞吞噬和消化功能,,激活白細(xì)胞吞噬功能,并能改善細(xì)胞抑制劑所導(dǎo)致的白細(xì)胞減少,,從而增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力,。
溶菌酶還具有激活血小板的功能,可以改善組織局部血液循環(huán)障礙,,分泌膿液,,增強(qiáng)局部防衛(wèi)功能,從而體現(xiàn)其止血,、消腫等作用,。它還可以作為一種宿主抵抗因子,對(duì)組織局部起保護(hù)作用,。
溶菌酶在嬰兒體內(nèi)可以直接或間接促進(jìn)嬰兒腸道細(xì)菌雙歧乳酸桿菌的增殖,,促進(jìn)嬰兒消化吸收,可以促進(jìn)人工喂養(yǎng)嬰兒腸道細(xì)菌的正?;?;能夠加強(qiáng)血清滅菌蛋白(properdin),γ-球蛋白(γ-globulin)等體內(nèi)防御因子對(duì)感染的抵抗力,,特別對(duì)早產(chǎn)嬰兒有防御體重減輕,、預(yù)防消化器官疾病、增進(jìn)體重等功效,。
細(xì)菌的細(xì)胞壁由胞壁質(zhì)組成,,胞壁質(zhì)是由n-乙酰氨基葡萄糖(n-acetylglucosamine)及n-乙酰胞壁酸(n-acetylmuramicacid)交替組成的多聚物,胞壁酸殘基上可以連接多肽,,稱為肽聚糖(peptidoglycan),。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分,它是由nam,、nag和肽“尾”(一般是4個(gè)氨基酸)組成,,nam與nag通過(guò)β-1,4糖苷鍵相連,,肽“尾”則是通過(guò)d-乳酰羧基連在nam的第3位碳原子上,,肽尾之間通過(guò)肽“橋”(肽鍵或少數(shù)幾個(gè)氨基酸)連接,,nam,、nag,、肽“尾”與肽“橋”共同組成了肽聚糖的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),作為細(xì)胞壁的骨架,,上述結(jié)構(gòu)中的任何化學(xué)鍵斷裂,,皆能導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的損傷。溶菌酶能有效地水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖,,其水解位點(diǎn)是n-乙酰胞壁酸(nam)的1位碳原子和n-乙酰葡萄糖胺(nag)的4位碳原子間的β-1,,4糖苷鍵,結(jié)果使細(xì)菌細(xì)胞壁變得松弛,,失去對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用,,最后細(xì)胞溶解死亡。
對(duì)于g+細(xì)菌與g-細(xì)菌,,其細(xì)胞壁中肽聚糖含量不同,,g+細(xì)菌細(xì)胞壁幾乎全部由肽聚糖組成,而g-細(xì)菌只有內(nèi)壁層為肽聚糖,,因此,,溶菌酶只能破壞g+細(xì)菌的細(xì)胞壁,而對(duì)g-細(xì)菌作用不大,。