近日，法國(guó)大型生物技術(shù)公司Cellectis總裁安德烈·舒利卡先生(Andre Choulika)表示,，從現(xiàn)在起到2013年1月公司將證明基因組改造能使用微藻來(lái)制造第三代生物燃料,。目前Cellectis公司應(yīng)主要證明其技術(shù)在藻類(lèi)植物中的有效性,。
Cellectis公司研發(fā)了能夠干預(yù)脫氧核糖核酸(ADN)的分子剪刀,，通過(guò)此分子剪刀，公司能夠改變或更換疾病突變載體基因,，并改變植物機(jī)體,。該公司還負(fù)責(zé)實(shí)現(xiàn)分子剪刀的商業(yè)化。公司已經(jīng)將該技術(shù)推廣到生物生產(chǎn),、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)的學(xué)術(shù)研究中,。
基因組改造實(shí)驗(yàn)如果成功，從2013年1月起的未來(lái)四年內(nèi)公司將在法國(guó)石油化工集團(tuán)道達(dá)爾公司(Total)的協(xié)助下進(jìn)行石油代用品的試驗(yàn)生產(chǎn),。該階段的投資金額將達(dá)到數(shù)百萬(wàn)歐元。
根據(jù)雙方簽訂的協(xié)議,，Cellectis公司和道達(dá)爾公司將共同支付該項(xiàng)目所需的成本,。目前，兩家公司均沒(méi)有透漏相關(guān)的財(cái)務(wù)信息,。從2012年2月起十名研究人員就已經(jīng)開(kāi)始共同從事該項(xiàng)目的研究,，此外,，兩家公司將分別持有相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品50%的份額。舒利卡先生表示,，在最初幾年內(nèi),，該項(xiàng)目每年的開(kāi)發(fā)成本將至少為數(shù)百萬(wàn)歐元。而在試點(diǎn)階段,，所需金額將達(dá)到數(shù)千萬(wàn)歐元,。
基因組改造技術(shù)
普魯蘭酶基因克隆表達(dá)及枯草芽孢桿菌基因組的改造[1]
根據(jù)整合到基因組上的目的基因來(lái)源，分別構(gòu)建了兩種整合方式的載體,，即單交換和雙交換整合載體,。對(duì)于枯草芽孢桿菌本身來(lái)源的巰基-二硫鍵氧化還原酶基因bdbC，bdbD,，直接將其作為同源片斷,，由于bdbC，bdbD共用一個(gè)啟動(dòng)子,，在基因組上以操縱子的形式存在,，因此構(gòu)建的單交換載體命名為pACC-BdbDC。對(duì)于大腸桿菌來(lái)源的巰基-二硫鍵氧化還原酶基因ds.C,，dsbD,，dsbE，dsbG,，則需要在枯草芽孢桿菌基因組上選擇整合位點(diǎn),，在其整合位點(diǎn)附近各選取500bp基因作為同源片斷，克隆到pBSK-p1p4-Cm上,，構(gòu)建了基因敲除載體,。再將dsbC，dsbD,，dsbE,，dsbG插入到該載體的兩個(gè)同源片斷之間，分別構(gòu)建了雙交換載體pDGC和pDsbE,。將以上構(gòu)建好的單交換和雙交換載體分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌B.su.168,，結(jié)果巰基-二硫鍵氧化還原酶基因整合到枯草芽孢桿菌基因組上，成功改造了枯草芽孢桿菌遺傳背景,。
戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建及其改造[2]
傳統(tǒng)的以限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶為基礎(chǔ)的DNA重組技術(shù)曾經(jīng)革命性地推動(dòng)了分子生物學(xué)和遺傳工程的發(fā)展,，至今仍然發(fā)揮著重要作用。但是實(shí)驗(yàn)室原有的片段太多,，找酶切位點(diǎn)比較困難,。用overlap pcr連成4個(gè)長(zhǎng)片段后就相對(duì)容易一些，利用4626位置上的KpnⅠ和載體上的XbaⅠ這兩個(gè)酶切位點(diǎn)將中間兩段連接，從而形成3個(gè)大片段（1～2474,，2094～6645,，5186～7232）。In-fusion法的原理跟基因同源重組類(lèi)似,，利用DNA片段的同源關(guān)系將目的片段定向地插入載體中,。這個(gè)方法只需一個(gè)單一的酶切位點(diǎn)將載體線性化即可，不需要兩個(gè)單一的酶切位點(diǎn),，條件沒(méi)有前面苛刻,，所以結(jié)合這個(gè)方法用于最后兩步連接。先利用載體上的XbaⅠ酶切位點(diǎn)將前兩段連接（1～5318）,，然后利用5245位置上的FseⅠ酶切位點(diǎn)將最后兩段連成HEV的全長(zhǎng)cDNA,。In-fusion法需要重新設(shè)計(jì)引物，使目的基因的兩端帶有載體兩端的同源序列,。雖然也涉及到PCR過(guò)程,，但是以質(zhì)粒為模板，難度相對(duì)overlap PCR要小,，可以擴(kuò)增3kb左右大小的片段用于連接,。
為了保證這個(gè)HEV的全長(zhǎng)cDNA克隆具有感染性，又對(duì)它進(jìn)行了修正,。在測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)5’端有94個(gè)堿基與原序列比對(duì)不上,，另外在2467的位置多出了5個(gè)堿基，我們需要將這一段替換掉,。為了保證序列的準(zhǔn)確性,，重新從病料中提取SAAS-JDY5株的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）,。設(shè)計(jì)套式特異性引物,，并在5’端引入T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，進(jìn)行巢式PCR（Nest-PCR）擴(kuò)增出目的片段,，用新的正確的片段替換掉原來(lái)錯(cuò)誤的片段,，獲得正確的SAAS-JDY5株HEV的全長(zhǎng)cDNA克隆。
