夫良藥苦于口,，而智者勸而飲之，知其入而已己疾也
《韓非子·外儲(chǔ)說(shuō)左上》有云 ：“”,，良藥苦口由此而來(lái),。最近，國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)揭開了這類“苦口良藥”的神秘面紗,，成果相繼發(fā)表在Nature Genetics(2013),、Science(2014)和Nature Plants(2016)等國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊上,。研究者通過(guò)研究黃瓜發(fā)現(xiàn)：黃瓜苦味正是由三萜化合物葫蘆素C導(dǎo)致的，僅在葫蘆科植物中(黃瓜,、西瓜和甜瓜等)發(fā)現(xiàn),，苦是這類化合物最顯著的特點(diǎn)，因此,，葫蘆素也叫苦味素,。極低量的葫蘆素(0.1 mg/L)就能引起明顯的苦味,，比典型的苦味劑咖啡因還要苦100倍左右,。
苦味素的發(fā)現(xiàn)對(duì)黃瓜育種和抗腫瘤藥物開發(fā)具有重大的意義。
植物的生長(zhǎng)面對(duì)各種外界生物脅迫和非生物脅迫,，極苦的苦味素是最佳的防御武器,，可用來(lái)抵御病蟲害的侵入。因此,，苦味素是保護(hù)植物的 “綠色農(nóng)藥”,。科學(xué)家通過(guò)黃瓜功能基因組研究和代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),，可以通過(guò)控制黃瓜葉片和果實(shí)中苦味素差異積累,，培育出葉苦果實(shí)不苦的超級(jí)優(yōu)良黃瓜品種。
苦味素對(duì)于腫瘤的治療具有非常好效果,。
在印度,，極苦的野生黃瓜果實(shí)和葉片除了被用作瀉藥，還被用于治療各種炎癥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),，甜瓜瓜蒂中的苦味素被提取出來(lái)并開發(fā)成治療肝病的有效藥物。近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的苦味素藥用價(jià)值引起了人們的關(guān)注,，由于黃瓜中苦味素含量極低,，因此通過(guò)解析苦味素代謝通路和合成生物學(xué)技術(shù)，提高苦味素的含量對(duì)于產(chǎn)業(yè)化苦味素應(yīng)用于臨床腫瘤治療具有非常重大的醫(yī)學(xué)意義,。
“基因組反應(yīng)了可能將要發(fā)生的事情,，轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)了將要發(fā)生的事情，而代謝組反應(yīng)了正在或者已經(jīng)發(fā)生的事情”,。
苦味素是一種次生代謝物,，屬于是代謝組學(xué)的研究范疇。什么是代謝組? 生物體的表型性狀是由代謝物的積累直接體現(xiàn)的,，如水稻在旱脅迫過(guò)程中,，水稻葉片ABA的含量會(huì)明顯提高;當(dāng)花青素的含量在西紅柿果實(shí)中過(guò)量積累時(shí)，西紅柿的果實(shí)顏色將由紅色變成紫色;長(zhǎng)春花長(zhǎng)期以來(lái)被視為最有效的抗癌植物材料之一,，而其中有效的抗癌活性物質(zhì)是長(zhǎng)春花堿(一種生物堿),。因此，植物功能基因組的研究最終都會(huì)落實(shí)到代謝組與表型組研究中來(lái)。
怎樣才能將“基因組-轉(zhuǎn)錄組-代謝組”系統(tǒng)的結(jié)合起來(lái),，開展基礎(chǔ)科學(xué)研究,、技術(shù)轉(zhuǎn)化及育種呢？
苦味素的發(fā)現(xiàn),，是我國(guó)科學(xué)家由基礎(chǔ)科學(xué)研究到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的成功典范,，也是基因組與代謝組多組學(xué)、多學(xué)科整合的成功案例,。今天小編將系統(tǒng)性的介紹黃瓜功能基因組研究如何從最初的基礎(chǔ)科學(xué)研究到新品種選育以及抗癌藥物研發(fā)的科學(xué)故事,。
基礎(chǔ)研究：從無(wú)到有，由小到大的科研之路
1.黃瓜核心種質(zhì)資源庫(kù)的構(gòu)建
核心種質(zhì)資源庫(kù)將為黃瓜育種提供新的材料平臺(tái),。
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)搜集世界各地的黃瓜種質(zhì)資源共3300多份材料進(jìn)行了播種和性狀調(diào)查,。經(jīng)過(guò)前期設(shè)計(jì)的23對(duì)SSR引物，對(duì)3300多份材料進(jìn)行了指紋圖譜分析(如圖4),，根據(jù)指紋圖譜,，分析了世界黃瓜系譜的演化歷史，挑選了有代表性的黃瓜材料115份,，作為黃瓜的核心種質(zhì)資源庫(kù),，可代表所有黃瓜資源 77.2%以上的遺傳多樣性，
2.構(gòu)建黃瓜基因組的HapMap圖譜
印度群體
通過(guò)第二代高通量測(cè)序技術(shù)完成上述挑選的115個(gè)黃瓜品系重測(cè)序,，并對(duì)一個(gè)野生黃瓜進(jìn)行了從頭測(cè)序,。基于這些重測(cè)序數(shù)據(jù),，構(gòu)建起一個(gè)單核苷酸分辨率的黃瓜遺傳變異圖譜,。將黃瓜群體分為了4個(gè)分化明顯的群體，包括黃瓜的野生祖先,，及其衍生亞群：),。同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)西雙版納黃瓜特有的突變,，該突變導(dǎo)致了編碼β-胡蘿卜素羥化酶的基因是去功能,，從而使得西雙版納黃瓜在果實(shí)成熟期因不能降解β-胡蘿卜素而呈橙色。這一發(fā)現(xiàn)為培育營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高的黃瓜新品種提供了分子育種思路,。
3.黃瓜基因表達(dá)譜研究
轉(zhuǎn)錄組研究
完成基因組測(cè)序后,，為了進(jìn)一步研究黃瓜基因表達(dá)水平的差異，該團(tuán)隊(duì)提取了10個(gè)黃瓜組織的RNA進(jìn)行,，這些數(shù)據(jù)一方面提高了黃瓜基因組基因注釋的可靠性和完整性,，另一方面也發(fā)現(xiàn)了與黃瓜的性別分化、卷須發(fā)育和單性結(jié)實(shí)等相關(guān)的重要基因 300多個(gè),，進(jìn)一步豐富了黃瓜功能基因研究,。
4.黃瓜果實(shí)品質(zhì)等重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的挖掘
重復(fù)序列與全雌性高度相關(guān)
利用重測(cè)序結(jié)果挖掘了約 1500 個(gè)馴化相關(guān)基因,，闡明了人工馴化和遷移對(duì)黃瓜基因組的影響。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析,，發(fā)現(xiàn)了決定黃瓜性別重要性狀的關(guān)鍵基因(如圖7),，為進(jìn)一步研究基因功能提供了重要信息。黃瓜這種不尋常特性是由一個(gè)30kb大小DNA片段的拷貝數(shù)增加引起,，這段,。對(duì)全雌花植物來(lái)說(shuō)，有很大的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)潛力,。這些基因組結(jié)構(gòu)的變異成為將來(lái)研究黃瓜基因功能的重要資源,，并為充分利用結(jié)構(gòu)變異改良作物，提供了理論基礎(chǔ),。
5.黃瓜苦味素合成和β-胡蘿卜素合成的分子機(jī)制
代謝組是植物農(nóng)藝性狀和蔬菜營(yíng)養(yǎng)功能的直接體現(xiàn),。
完成基因組和轉(zhuǎn)錄組等研究后,，黃瓜的品質(zhì)性狀研究(代謝組)成為下一個(gè)需要突破的研究方向,，基于前期功能的研究和后續(xù)代謝組技術(shù)的應(yīng)用，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并證明了控制黃瓜苦味素合成的基因信息：控制黃瓜苦味素合成的關(guān)鍵基因簇,，是由5個(gè)串聯(lián)基因組成,，其中三萜合成酶基因的關(guān)鍵突變導(dǎo)致了黃瓜苦味素的合成與否，進(jìn)一步通過(guò)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),，證實(shí)了該基因簇具有合成苦味素的功能,。同時(shí)，利用生物信息學(xué)篩選,、及高效液相色譜檢測(cè)(代謝組檢測(cè))等生化分析發(fā)現(xiàn)了β-胡蘿卜素水解酶基因的關(guān)鍵突變位點(diǎn),，闡明了
短短幾年時(shí)間，我國(guó)黃瓜基因組研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)性的結(jié)合“基因組-轉(zhuǎn)錄組-代謝組”,，在科學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域產(chǎn)出了一系列重大學(xué)術(shù)成果：Nature Genetics(2009,，黃瓜基因組研究)，Nature(2011,，馬鈴薯基因組研究),，Nature Genetics(2013，黃瓜重測(cè)序研究),，Science(2014,，黃瓜苦味合成調(diào)控機(jī)制)，Plant Cell(2015,，拷貝數(shù)變異決定黃瓜生殖性別),，Nature Plants(2016，葫蘆科作物苦味性狀的趨同馴化與差異進(jìn)化),，這些基礎(chǔ)科學(xué)研究成果奠基了我國(guó)在黃瓜等蔬菜領(lǐng)域基礎(chǔ)研究的國(guó)際領(lǐng)先水平,。
育種應(yīng)用：基因組結(jié)合代謝組解析黃瓜苦味物質(zhì)的代謝調(diào)控與新品種培育
9個(gè)基因負(fù)責(zé)苦味物質(zhì)生物合成的代謝路徑,，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這9個(gè)基因由兩個(gè)“主開關(guān)”基因
2014年11月28日出版的國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊《Science》以長(zhǎng)篇幅論文(Research Article)的形式發(fā)表了我國(guó)科學(xué)家完成的黃瓜苦味合成、調(diào)控及馴化分子機(jī)制研究,。這項(xiàng)研究綜合采用了基因組,、轉(zhuǎn)錄組、分子生物學(xué)和代謝組學(xué)等多種技術(shù)手段,，解決了長(zhǎng)期影響黃瓜生產(chǎn)的一個(gè)重大應(yīng)用問(wèn)題,。該科研團(tuán)隊(duì)，先后開展了黃瓜基因重測(cè)序,，從1000kg瓜葉中提煉出數(shù)毫克的苦味元素(因?yàn)槠胀ùx組檢測(cè)技術(shù)靈敏度低,，難以檢測(cè)到低豐度的次生代謝產(chǎn)物)。通過(guò)深入挖掘基因組學(xué)數(shù)據(jù)并結(jié)合代謝組學(xué),、遺傳學(xué),、分子生物學(xué)等多種研究手段，揭示了(Bi和Bt)直接控制,，Bi控制葉片苦味,，Bt控制果實(shí)苦味。在野生黃瓜向栽培黃瓜馴化過(guò)程中,，Bt基因受到選擇,，導(dǎo)致無(wú)苦味黃瓜的出現(xiàn)。但這個(gè)馴化過(guò)程并不完全,，黃瓜在逆境條件下生長(zhǎng)仍然會(huì)變苦,。
Bt啟動(dòng)子區(qū)域有一個(gè)新的突變體--SNP1601，能夠使Bt基因在逆境中不表達(dá),，
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),，可控制黃瓜不會(huì)變苦，從而徹底避免苦味對(duì)黃瓜品質(zhì)的影響,。黃瓜苦味合成,、調(diào)控及馴化分子機(jī)制的解析，為綜合利用苦味物質(zhì)葫蘆素創(chuàng)造了契機(jī),。通過(guò)控制葉片和果實(shí)中的“開關(guān)”基因 Bi和 Bt,，可培育一個(gè)新的“超級(jí)黃瓜”品種： 既能利用自身合成的苦味物質(zhì)進(jìn)行蟲害防御，減少農(nóng)藥使用;又可確保果實(shí)中無(wú)苦味合成,，保障蔬菜商品品質(zhì),。育種專家們正在利用這個(gè)分子育種方案培育新型黃瓜品種。這是蔬菜基因組研究直接用于品種改良的優(yōu)秀范例,。
藥物開發(fā)：黃瓜苦味物質(zhì)開發(fā)與人類健康
植物中有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的大相對(duì)分子質(zhì)量次生代謝化合物,，它們?cè)谥参锱c外界環(huán)境相互作用過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用。其中萜類化合物是中草藥中的一類比較重要的化合物,，主要包含單萜,、倍半萜,、二萜和三萜等。黃瓜苦味正是由三萜化合物葫蘆素C導(dǎo)致的一類高度氧化的四環(huán)三萜化合物,，僅在葫蘆科植物中(黃瓜,、西瓜和甜瓜等 )被發(fā)現(xiàn)，如西瓜和甜瓜中分別富含葫蘆素E和B,。
黃瓜苦味物質(zhì)葫蘆素具有很好的藥用價(jià)值,。最早在《本草綱目》中就記載富含葫蘆素的甜瓜瓜蒂具有催吐及消炎的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),，甜瓜瓜蒂中含有大量的葫蘆素,，正是它們發(fā)揮了消炎和保肝功效。因此,，大量的葫蘆素被提取出來(lái)并開發(fā)成治療肝病的有效藥物,。近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的葫蘆素藥用價(jià)值引起了人們的關(guān)注：治療癌癥。葫蘆素可通過(guò)特異阻斷腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需的JAK-STAT信號(hào)通路來(lái)抑制肝癌,、膀胱癌,、胰腺癌等癌細(xì)胞的擴(kuò)散，可與其他抗癌藥物一塊使用,，提高癌癥治療的效果,。從這個(gè)角度來(lái)說(shuō),， “良藥苦口”是非常有道理的,。
雖然野生的葫蘆科植物非常苦,，但是,，苦味素在植物中的含量并不高，要獲得足量多的葫蘆素進(jìn)行藥物開發(fā)和治療,，就必須從植物材料中進(jìn)行分離和純化,。不論是前期大面積的植物種植，還是后期復(fù)雜繁瑣的純化過(guò)程,，都需要大量的時(shí)間和很高的成本,。葫蘆素屬于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，利用化學(xué)方法進(jìn)行合成的難度非常大,，且面臨環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn),。因此，要進(jìn)一步挖掘葫蘆素的藥物潛力,，必須借助生物合成的方法進(jìn)行生產(chǎn),，而生物合成的前提是植物中苦味物質(zhì)合成代謝通路必須清楚。一旦苦味素代謝合成通路構(gòu)建完成,，可以采用類似體外合成青蒿素的技術(shù),，將整個(gè)葫蘆素合成代謝通路導(dǎo)入酵母基因組,，通過(guò)發(fā)酵的方式快速、高效合成和改良葫蘆素,，為未來(lái)開發(fā)新的抗癌藥物提供了新的思路和借鑒,。
目前，由于現(xiàn)有的非靶向代謝組技術(shù)的一些局限性,，還無(wú)法快速解析不同葫蘆科不同物種的苦味素精細(xì)合成通路,，延緩了后續(xù)開展苦味素藥物開發(fā)的應(yīng)用。隨著廣泛靶向代謝組技術(shù)的建立,，高通量的精確檢測(cè)代謝物成為了可能,，為苦味素的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了新的技術(shù)平臺(tái)。
廣泛靶向代謝組：創(chuàng)新的高通量代謝組檢測(cè)技術(shù)
廣泛靶向代謝組(Widely Targeted metabolome)：一種整合了非靶向和靶向代謝物檢測(cè)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的新型代謝組檢測(cè)技術(shù),，實(shí)現(xiàn)了高通量,、高靈敏、廣覆蓋的靶向代謝物檢測(cè),，為高效批量定性,、定量檢測(cè)低豐度代謝物提供了理想的手段。
隨著廣靶靶向代謝組技術(shù)(廣靶,，Widely Targeted metabolome)的建立,，高通量的檢測(cè)鑒定黃瓜重要代謝通路的物質(zhì)成為可能，從而避免文中報(bào)道的需要從1噸黃瓜中提取微量苦味素,，再通過(guò)NMR(核磁共振)技術(shù)鑒定物質(zhì),，一方面研究成本較高，周期較長(zhǎng),，同時(shí)鑒定到的物質(zhì)種類非常少,，屬于靶向代謝組檢測(cè)。目前,，邁維代謝提供的廣泛靶向代謝組檢測(cè)技術(shù)(廣靶)服務(wù),，需要提供3-5g鮮樣，批量鑒定1000種代謝物以上,，使得代謝組檢測(cè)鑒定物質(zhì)水平大大提高,，成功應(yīng)用在水稻、玉米,、油菜,、草莓、甜橙等材料中,。
基于廣泛靶向代謝組檢測(cè)技術(shù),，可以有效鑒定和定位葫蘆素完整合成代謝通路物質(zhì)和基因，最終通過(guò)發(fā)酵的方式快速,、高效合成和改良苦味素,，為未來(lái)開發(fā)新的抗癌藥物提供了新的方向,。
在功能基因定位和挖掘研究上，基于廣泛靶向代謝組的代謝組全基因組關(guān)聯(lián)分析(metabolic Genome Wide Association Study,，mGWAS),，在群體材料中可以批量定位近百個(gè)基因，優(yōu)勢(shì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)GWAS分析,。形成了基因組研究與表型組研究(生物學(xué)功能研究)的有效紐帶,，相關(guān)成果發(fā)表在Nature Genetics、Nature Communications,、PNAS和Plant Cell等期刊,。因此，
展望：苦味素藥物開發(fā)與代謝組學(xué)研究
黃瓜功能基因組學(xué)的發(fā)展,，較為系統(tǒng)的完成了系統(tǒng)生物學(xué)的研究范疇,，通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組的多組學(xué)分析,，獲得了黃瓜龐大的基因組信息資源,，解析了黃瓜苦味素物質(zhì)，為后續(xù)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ),。
不久將來(lái),，廣泛靶向代謝組技術(shù)將更多的與其他組學(xué)結(jié)合，解析基因功能和表型性狀,，包括苦味素合成通路的其他中間代謝物,。
代謝組是基因組的最終產(chǎn)物，是植物體表型性狀的直接體現(xiàn),。2015年《Science》雜志提到,，What’s Next in'Omics： The metabolome，代謝組將是下一個(gè)關(guān)注和快速發(fā)展的組學(xué),。小編相信，最終希望通過(guò)廣泛靶向代謝組技術(shù)解析整個(gè)苦味素合成代謝通路物質(zhì),，通過(guò)發(fā)酵的方式快速,、高效合成和改良葫蘆素，為未來(lái)開發(fā)新的抗癌藥物提供了新的思路和借鑒,，成為我國(guó)下一個(gè)“青蒿素”,。
12月16日，邁維代謝將帶著最前沿的“廣泛靶向代謝組”技術(shù),，期待在腫瘤營(yíng)養(yǎng)代謝大會(huì)上與您碰撞出科研的火花!
