撰文 生物工廠研究小組*(Bio Fab Group)
雖然“基因工程”這個(gè)詞已至少用了30年，DNA重組技術(shù)也是現(xiàn)代生物學(xué)研究的主流技術(shù)，但是大多數(shù)生物工程學(xué)家所進(jìn)行的生物相關(guān)研究,，卻與工程技術(shù)鮮有共同之處。其中一個(gè)原因就是,，現(xiàn)有的生物工具,，在標(biāo)準(zhǔn)化和實(shí)用性方面還沒有達(dá)到與其他工程技術(shù)領(lǐng)域相應(yīng)的水平；而另一個(gè)原因,，則是生物學(xué)的研究方法和思路還有待改進(jìn),，盡管生物學(xué)研究已經(jīng)深受工業(yè)技術(shù)的影響。
舉例來(lái)說(shuō),，電子工程的轉(zhuǎn)型起始于1957年,。那一年，美國(guó)Fairchild半導(dǎo)體公司(這家公司的所在地就是后來(lái)的硅谷)的瓊·霍爾尼(Jean Hoerni)和羅伯特·N·諾伊斯(Robert N.Noyce)發(fā)明了平面技術(shù),。這是一種利用光掩模(photomask),，在硅晶圓(silicon wafer)內(nèi)，對(duì)金屬及化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行層疊和刻蝕的系統(tǒng),。利用這種新技術(shù),，工程師們不僅能夠制造出品質(zhì)穩(wěn)定的、簡(jiǎn)潔的集成電路,，還能通過(guò)改變光掩模的模式,，制造出各種類型的電路。此后不久,，工程師們就可以對(duì)前人所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)單電路進(jìn)行選擇組合,，設(shè)計(jì)出更加復(fù)雜、應(yīng)用范圍更廣的電路,。
在那個(gè)年代,，電子電路的標(biāo)準(zhǔn)制造方法還比較原始，只是將電路的各個(gè)晶體管(transistor)逐一串連起來(lái),。這是一種手工制造過(guò)程,，其產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，被新興電子工業(yè)界公認(rèn)為技術(shù)瓶頸,。相反,，平面技術(shù)則大步前進(jìn)，進(jìn)展速度驚人,，與著名的摩爾定律(Moore’s Law)所提出的速度相差無(wú)幾,。
半導(dǎo)體芯片的設(shè)計(jì)制造技術(shù)與方法學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物—— 芯片制造廠(chip fab)，已成為史上最成功的工程范例之一,。它也為另一新興技術(shù)領(lǐng)域—— 生物體系制造業(yè),，提供了寶貴的發(fā)展模式。
實(shí)際上，今天的基因工程師所使用的方法,，仍處于較原始的階段,。正如我們的同事，美國(guó)麻省理工學(xué)院人工智能實(shí)驗(yàn)室的湯姆·奈特(Tom Knight)所說(shuō)的那樣：“DNA序列的組裝技術(shù)沒有標(biāo)準(zhǔn)化,，致使每一次DNA組裝反應(yīng)在自身還處于實(shí)驗(yàn)階段的同時(shí),，就不得不充當(dāng)解決目前研究課題的實(shí)驗(yàn)工具。”
生物工程在制造方法和組件上的標(biāo)準(zhǔn)化,，可以促使兼容組件設(shè)計(jì)庫(kù)建立，并使組件的加工外包成為可能,。理論與制造的分離,，使生物工程師能夠自由地構(gòu)想更加復(fù)雜的裝置，并應(yīng)用強(qiáng)大的工程工具(例如計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)),，來(lái)處理由此而來(lái)的復(fù)雜性,。向著這些目標(biāo)，我們小組的成員已經(jīng)開始尋找和開發(fā)能夠構(gòu)成“生物工廠”(bio fab)基礎(chǔ)的儀器和工藝技術(shù),。我們還想組建一個(gè)團(tuán)隊(duì),，然后借團(tuán)隊(duì)的力量，將最好的工程原理和實(shí)踐應(yīng)用于生物技術(shù),。
合成DNA
如果說(shuō)單個(gè)的晶體管是電子電路的基本組件,，那么在生物學(xué)中，與之對(duì)應(yīng)的便是基因(有序的DNA片段),。為了給高級(jí)的生物裝置構(gòu)建基因電路(genetic circuit),，我們就需要一種快速可靠、價(jià)格合理的DNA片段合成法,。
20年前，在前人的工作基礎(chǔ)上,，美國(guó)科羅拉多大學(xué)博爾德分校(University of Colorado at Boulder)的馬文·H·卡拉瑟斯(Marvin H.Caruthers),，利用DNA自身的化學(xué)性質(zhì)，研發(fā)出一種單鏈DNA合成法,。DNA由4種核苷酸組成,，而每種核苷酸又含有一個(gè)相應(yīng)的堿基，分別是腺嘌呤(adenine,，A),、胞嘧啶(cytosine，C),、鳥嘌呤(guanine,，G)和胸腺嘧啶(thymine，T),。堿基之間的親和力使它們兩兩配對(duì)(A-T配對(duì),，G-C配對(duì))，形成梯狀雙鏈DNA分子中的梯級(jí),?；瘜W(xué)鍵不僅在堿基對(duì)之間形成，在鄰近的核苷酸之間也會(huì)形成,。
卡拉瑟斯所使用的方法被稱為固相亞磷酰胺法,，這是目前大多數(shù)商業(yè)DNA合成法的基礎(chǔ)。合成反應(yīng)起始于一個(gè)單核苷酸,，這可不是一個(gè)普通的核苷酸，它附著在懸浮于酸性液體中的固相支持物(如聚苯乙烯顆粒)上,，并承擔(dān)著發(fā)起合成反應(yīng)的重任,。當(dāng)碰見“新來(lái)”的核苷酸,，兩者便會(huì)通過(guò)形成化學(xué)鍵相連,。如果不斷加入核苷酸,，反應(yīng)就會(huì)持續(xù)進(jìn)行,，核苷酸鏈就會(huì)不斷延長(zhǎng)。這樣,，就可以合成任何想要的核苷酸序列,，并且不易出錯(cuò)(出錯(cuò)幾率約為1%)。
但很多時(shí)候,，生物工程師想要的基因片段，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了該方法的合成能力,。一個(gè)簡(jiǎn)單的基因網(wǎng)絡(luò)也許就有數(shù)千堿基對(duì),；就算像細(xì)菌這樣的微小生物，基因組也可達(dá)數(shù)百萬(wàn)堿基對(duì),。因而,，我們?nèi)绻胝业礁弋a(chǎn)出、低誤差的合成法,，就只能寄希望于從自然界中獲得一些提示了,。
在生物體中，像酶(如聚合酶)這樣的生物機(jī)器,，能以高達(dá)每秒500個(gè)堿基的速度,，合成和修復(fù)DNA分子，而錯(cuò)誤率僅為十億分之一！這就意味著,，即便是最好的DNA合成機(jī)器(每300秒合成1個(gè)堿基),，產(chǎn)出率(輸出量/錯(cuò)誤率)也不及聚合酶的萬(wàn)億分之一。更有甚者,，在細(xì)菌體內(nèi),，當(dāng)復(fù)制像基因組那樣的長(zhǎng)鏈DNA時(shí),，多個(gè)聚合酶會(huì)同時(shí)運(yùn)作,，在20分鐘內(nèi)就能合成含有500萬(wàn)個(gè)堿基的DNA！
于是,，丘奇開始仿效細(xì)菌聚合酶的這種平行作業(yè)方式,，以適應(yīng)現(xiàn)有的基因芯片技術(shù)?；蛐酒鋵?shí)就是特殊的玻璃片,，在它的表面上，繁星般地點(diǎn)綴著長(zhǎng)為50～70個(gè)堿基的寡核苷酸(oligonucleotide/oligo,，短小的核苷酸鏈),。通過(guò)亞磷酰胺反應(yīng)法，寡核苷酸被同時(shí)合成于基因芯片的表面,，并以格狀排列,，密度高達(dá)100萬(wàn)點(diǎn)/平方厘米。在傳統(tǒng)技術(shù)的基礎(chǔ)上,，我們又在這些寡核苷酸上加上可剪切的連接子,，以便特定的寡核苷酸能夠從基因芯片上釋放出來(lái)。在我們的實(shí)驗(yàn)性基因芯片上,，每個(gè)點(diǎn)約為30微米寬,，含有大約1000萬(wàn)個(gè)寡核苷酸分子。
通常,，基因芯片上的核苷酸鏈被稱為構(gòu)建性寡核苷酸(construction oligo),，因?yàn)樗鼈兊牟糠中蛄惺窍嗷ブ丿B的，通過(guò)重疊的序列,，可將它們組裝成更長(zhǎng)的DNA結(jié)構(gòu)(如整個(gè)基因)。但是,，任何含有錯(cuò)誤序列的寡核苷酸都必須被清除,。為此，我們采用了兩種不同的糾錯(cuò)方法,。
第一種是選擇性寡核苷酸(selection oligo)法,。合成選擇性寡核苷酸的方法與制造基因芯片的方法相同，只是在核苷酸序列上，前者有特殊的要求：與構(gòu)建性寡核苷酸的序列互補(bǔ),。合成之后,，便對(duì)連接子進(jìn)行剪切，從玻璃片上釋放選擇性寡核苷酸,，并使它們流過(guò)構(gòu)建性寡核苷酸的芯片,。按照堿基配對(duì)的原則，選擇性寡核苷酸就會(huì)與互補(bǔ)的構(gòu)建性寡核苷酸結(jié)合(雜交,，hybridize),，形成雙鏈DNA。這樣,，任何不能配對(duì),，或者含有錯(cuò)誤序列、配對(duì)不完全的構(gòu)建性寡核苷酸,，都無(wú)法逃過(guò)我們的“法眼”,，也就無(wú)法繼續(xù)在芯片上“濫竽充數(shù)”。與制造基因芯片一樣,，在合成時(shí),，選擇性寡核苷酸的序列也會(huì)出錯(cuò)。但是,，構(gòu)建性與選擇性寡核苷酸的錯(cuò)誤序列很難完全互補(bǔ),。因此，利用一組寡核苷酸對(duì)另一組進(jìn)行校對(duì)是一種有效的糾錯(cuò)方法,。利用這種方法,，我們合成寡核苷酸的平均錯(cuò)誤率可以低至1/1,300。
正如人們所料,，生物體系非常注重自身復(fù)制的精確度,。我們的第二種糾錯(cuò)方法就來(lái)源于自然界。十年前,，莫德里奇首先發(fā)現(xiàn)了生物體系復(fù)制時(shí)的詳細(xì)糾錯(cuò)過(guò)程,，并將這個(gè)過(guò)程命名為“MutS,L,H”。當(dāng)兩條DNA鏈的堿基不能完全配對(duì)時(shí),，那么在錯(cuò)配區(qū),，便不能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。MutS是一種天然存在的蛋白,，它會(huì)識(shí)別這種缺陷,，并與之結(jié)合。隨后,，它招集“同伴”—— MutL和MutH,，共同完成修正任務(wù),。利用該方法，雅各布森與美國(guó)麻省理工學(xué)院的彼得·卡爾(Peter Carr),，已經(jīng)將DNA合成的錯(cuò)誤率降到1/10,000,。對(duì)于生產(chǎn)小型基因網(wǎng)絡(luò)，這樣的保真度足矣,。
在可釋放性平行合成技術(shù)和糾錯(cuò)技術(shù)的支持下,，長(zhǎng)鏈DNA的合成速度更快、成本更低,、精確度更高,。這些技術(shù)將是生物工廠的基礎(chǔ)，隨著時(shí)間的流逝,，它們會(huì)像半導(dǎo)體芯片光刻技術(shù)那樣,，不斷進(jìn)步。先進(jìn)的技術(shù)是寶貴的財(cái)富,，能解放我們的思想,，讓我們思考更多：在生物工廠里，我們可以做些什么呢,？
基因工程藥物
利用生物工廠的平臺(tái)探索征服疾病的新方法,，是我們最早的目標(biāo)之一?；沽趾拓惪说难芯繉?duì)象是瘧疾和艾滋病——兩種困擾人類多年的惡疾,，他們致力于開發(fā)對(duì)付這兩種疾病的藥物。盡管我們所研究的治療方法與他們的不盡相同,，但在很大程度上,，兩個(gè)小組的研究都依賴于精確合成長(zhǎng)鏈DNA的能力。我們的研究只是工廠化的一個(gè)代表,，工廠化擁有強(qiáng)大的力量,，必將顛覆傳統(tǒng)的新藥開發(fā)模式！
以瘧疾為例,，已有藥物能將感染者體內(nèi)的致病寄生蟲徹底消滅,，從而根治瘧疾。這是一種小分子藥物,，叫做C-15倍半萜(sesquiterpene),，俗名青蒿素(artemisinin)，是由青蒿植物(sweet wormwood,，多發(fā)現(xiàn)于中國(guó)華北地區(qū))合成的天然化合物,。但在植物中，天然合成的青蒿素過(guò)少,，造成青蒿素的價(jià)格極其昂貴,，無(wú)法推廣。因此,，在過(guò)去五年中,，基斯林的研究小組努力克隆合成青蒿素的遺傳途徑，并將它插入酵母菌中,，讓酵母菌大量合成青蒿素,。
在酵母菌中，我們還能對(duì)遺傳途徑進(jìn)行改良,，使青蒿素的合成效率大幅提高,。青蒿素的合成途徑叫作甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway)，目前,，我們已經(jīng)能夠?qū)ν緩街械年P(guān)鍵基因進(jìn)行重新設(shè)計(jì),。較之細(xì)菌中的原始途徑，關(guān)鍵基因的改變可使青蒿酸(amorphadiene,，青蒿素的前體)的產(chǎn)量提高10萬(wàn)倍,！但這仍然不夠，要使青蒿素得到廣泛應(yīng)用,，必須進(jìn)一步提高產(chǎn)量,。這就需要我們對(duì)整個(gè)青蒿素途徑進(jìn)行綜合重建。
整條遺傳途徑由九個(gè)基因構(gòu)成,，每個(gè)基因的平均長(zhǎng)度約為1,500個(gè)核苷酸,。因此，我們所構(gòu)建的每個(gè)新途徑大約包含13,000個(gè)核苷酸,。另外,，還需要制造每個(gè)基因的突變型，再對(duì)不同基因的突變型進(jìn)行組合,，挑選出最優(yōu)組合,。假若為每個(gè)基因制造兩種突變型，那么,，我們就得合成29即512條遺傳途徑,，共約600萬(wàn)個(gè)核苷酸！對(duì)于傳統(tǒng)DNA合成技術(shù),，這項(xiàng)任務(wù)無(wú)疑難于登天,；而對(duì)于基因芯片合成技術(shù)，這不過(guò)是小事一樁,。
工廠化技術(shù)不僅可以用于大規(guī)模合成基因網(wǎng)絡(luò),，還可以用于創(chuàng)造新型蛋白，例如化學(xué)合成反應(yīng)或治理環(huán)境污染所使用的新型催化劑,，以及用于基因療法或殺滅病原體的高特異性酶,。貝克的研究小組正在開發(fā)一種計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)法,，用于設(shè)計(jì)新型蛋白結(jié)構(gòu)。他們已設(shè)計(jì)出兩種新型蛋白,，可以模擬人類免疫缺陷病毒(HIV)表面的重要特征,。目前，這兩種蛋白已作為候選疫苗,，并進(jìn)入了測(cè)試階段,。
計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)法也有局限性：不夠先進(jìn)，不能保證設(shè)計(jì)出來(lái)的所有蛋白都具有期望中的功能,。但計(jì)算機(jī)可以設(shè)計(jì)出成百上千的,、有希望的候選蛋白，供我們?cè)囼?yàn),。如果把這些蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因序列,，那就需要合成上百萬(wàn)的核苷酸。對(duì)于現(xiàn)今的技術(shù),，這是一個(gè)困難而昂貴的方案,，但利用工廠化技術(shù)，可以毫不費(fèi)力地完成任務(wù),。
上述針對(duì)瘧疾和HIV的DNA,、蛋白質(zhì)合成研究表明，這種以生物工廠技術(shù)為基礎(chǔ)的方法,，可用于對(duì)付更多的疾病,，包括新出現(xiàn)的疾病。比如,，將高效而廉價(jià)的DNA測(cè)序方法[參見《環(huán)球科學(xué)》2006年第2期P.14喬治·M·丘奇《1000美元測(cè)出你的基因組》一文]與工廠合成能力相結(jié)合,，我們就可以快速鑒定新型病毒(如SARS病毒)或新型流感病毒，然后再以現(xiàn)有技術(shù)難以企及的速度,，制備相應(yīng)的蛋白疫苗,。
當(dāng)然，生物工廠并非只是一個(gè)高速合成技術(shù)的集合體,，而是一種方法：不僅對(duì)現(xiàn)有生物機(jī)器進(jìn)行思索,，而且借用工程學(xué)的語(yǔ)言和方法,構(gòu)建新型生物機(jī)器。
生物零件
2000年,，當(dāng)時(shí)就職于美國(guó)普林斯頓大學(xué)(Princeton University)的邁克爾·埃洛威茨(Michael Elowitz)和斯坦尼斯拉斯·萊布勒(Stanislas Leibler),，以及美國(guó)波士頓大學(xué)(Boston University)的柯林斯、蒂姆·加德納(Tim Gardner)和查爾斯·坎托(Charles Cantor)等人,，利用生物零件(biobrick)制造了第一批基本電路元件：一個(gè)環(huán)形振蕩器和一個(gè)扳鍵開關(guān),。他們的研究代表了人造功能性生物電路的首次成功。而早在1975年,，科學(xué)家們就已經(jīng)知道,，自然界的生物正是利用此類電路來(lái)調(diào)控它們的基因——從知道到成功,，科學(xué)家們用了整整25年的時(shí)間！
埃洛威茨和萊布勒的環(huán)狀振蕩器很好地闡釋了何為生物電路,。振蕩器的基本電路是一個(gè)質(zhì)粒(plasmid,，環(huán)狀DNA)，該質(zhì)粒帶有三個(gè)基因：tetR,、lacI和λcI，分別編碼三種蛋白：TetR,、LacI和λcI,。任何基因翻譯成蛋白質(zhì)的首要條件是,，聚合酶(polymerase)與基因上游區(qū)域的啟動(dòng)子(promoter)結(jié)合,。隨后，聚合酶將基因轉(zhuǎn)錄為信使RNA(messenger RNA),，然后信使RNA被翻譯成蛋白質(zhì),。如果聚合酶不能與啟動(dòng)子結(jié)合，那么基因就不能被翻譯,，也就不能生成蛋白質(zhì),。
埃洛威茨和萊布勒給三個(gè)基因的蛋白產(chǎn)物分配了特殊的任務(wù)：選擇性地與另外一個(gè)基因的啟動(dòng)子結(jié)合。如此一來(lái),，LacI蛋白與tetR的啟動(dòng)子結(jié)合,，λcI蛋白與lacI基因的啟動(dòng)子結(jié)合，而TetR蛋白則與λcI基因的啟動(dòng)子結(jié)合,。這種關(guān)聯(lián)性使得一個(gè)基因的蛋白產(chǎn)物能夠阻遏聚合酶與另一個(gè)基因的啟動(dòng)子結(jié)合,。因此，這三種蛋白的生成構(gòu)成了一個(gè)振蕩循環(huán)：大量LacI蛋白的生成抑制了tetR基因的表達(dá),；TetR蛋白的缺失使λcI基因得以表達(dá),；而λcI蛋白又抑制LacI蛋白的生成，這個(gè)過(guò)程不斷循環(huán),。
若將該循環(huán)中的一個(gè)基因與表達(dá)綠色熒光蛋白的基因相連,，再將整個(gè)電路轉(zhuǎn)入一個(gè)細(xì)菌中，那么你就會(huì)發(fā)現(xiàn)神奇的一幕：這個(gè)細(xì)菌會(huì)像節(jié)日彩燈般閃爍,！與之相似,，柯林斯小組最新研制的基因扳鍵開關(guān)也可用于細(xì)菌的程序化：一旦細(xì)菌的DNA受損，那么在細(xì)菌周圍就會(huì)出現(xiàn)一種跳躍著綠色熒光的“菌苔”,！
