使用微生物生產(chǎn)物質(zhì)的日本“家庭手工藝”，因價格低廉而開始變得風雨飄搖,。兩家大型公司所開發(fā)的新技術，把這種不安一下子吹得蕩然無存,。這樣一來,，日本就發(fā)現(xiàn)了繼續(xù)生存下去的光明大道,。
“發(fā)酵王國日本”的地位正在飄搖不定,。使用微生物制造產(chǎn)品本來是日本獨特的“傳統(tǒng)技藝”。但時至今日,，它的地位正在受到威脅,。新興國家的出現(xiàn)使制造業(yè)發(fā)生著巨大的變化，市場動向也處于不穩(wěn)定狀態(tài),。“產(chǎn)品的價格已經(jīng)不是由數(shù)量來決定的了”,，協(xié)和發(fā)酵工業(yè)生物化學公司的尾崎明夫開發(fā)部長的這句話，充分點明了問題的現(xiàn)狀,。
尾崎開發(fā)部長舉出了一個例子,，維生素C的世界市場具有5萬～6萬噸的規(guī)模．正在由大型企業(yè)所壟斷。中國制造的維生素C價格較低,，只要向市場投放一點點,，就會對維生素C的價格產(chǎn)生巨大的影響。
同樣的現(xiàn)象說不定在其他產(chǎn)品中也會產(chǎn)生,。味之素公司和美國AMD公司,、德國BASF公司、德國Degussa公司在全年總計75萬噸的飼料用氨基酸的市場中層開激烈的競爭,。面對這個市場,，目前中國也在建設裝置，據(jù)說供應能力可達10萬噸規(guī)模,。如果中國的裝置開始供應氨基酸,，則市場份額將會一舉發(fā)生改變。
日本的高附加價值產(chǎn)品投放市場 讓發(fā)酵制造商眼睛一亮的真本領
如果在誰都可以制造的產(chǎn)品和單純價格競爭的舞臺上去競爭的話,，則日本完全沒有取勝的可能,。為了生存，必須具備難以輕易模仿的劃時代生產(chǎn)技術,。
這樣的技術實際上在日本已經(jīng)開始出現(xiàn),。2004年秋季,，日本公布了開發(fā)出的新型發(fā)酵產(chǎn)品，點燃了使“發(fā)酵王國”再生的狼煙,。這就是被稱為二肽的由兩個氨基酸連接而成的化合物,。至今為止只能通過化學方法合成，日本國內(nèi)大型發(fā)酵企仆協(xié)和發(fā)酵工業(yè)和味之素相繼成功地利用微生物實現(xiàn)了生產(chǎn)的工業(yè)化,。
2004年9月,，協(xié)和發(fā)酵使用引入枯草桿菌基因的重組大腸桿菌，開發(fā)出發(fā)酵生產(chǎn)二肽的技術,。而2004年10月,，味之素也發(fā)表了與協(xié)和發(fā)酵不同的二肽生產(chǎn)技術。他們在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)了一種酯轉(zhuǎn)移酶,，使用這種酶實現(xiàn)了二肽生產(chǎn)技術的工業(yè)化,。兩家公司所發(fā)表的都是二肽丙谷酰胺的生產(chǎn)方法，但據(jù)說也可以推廣到其他約400種二肽的生產(chǎn)中,。
利用微生物使氨基酸和氨基酸簡單結合的技術,，對于想擴大氨基酸利用領域的兩家公司來說，確實是個無與倫比的課題．因此對于已經(jīng)成功的兩家公司,，其層次遠在單純成本競爭之上,，它是一種全新的技術。
靠基因組信息越過障礙 讓生物信息為人所利用
合成這種二肽的酶是連接氨基酸的單純的酶,，并非像所說的那樣可以馬上分離出來,。
微生物中存在著大量的分解肽的酶，二肽產(chǎn)生后會立即被分解,。以二肽本身的量為指標篩選微生物是很困難的,。
對于這一課題．味之素作為最大的氨基酸制造商，采用了多年積累的微生物改良專有技術,，一舉分離出了二肽合成酶(參見附文2),。
另一方面，協(xié)和發(fā)酵成功引進的則是最近才開始應用的新方法,，即利用計算機的insilico篩選系統(tǒng),。
當前，在公開的數(shù)據(jù)庫中,，已收錄了多種微生物的基因組信息,。協(xié)和發(fā)酵以此為對象，設想出二肽合成酶基因的應有形態(tài)結構,，檢索了與此一致的基因,。正是設想應有形態(tài)結構的想象力，才是發(fā)酵制造商的傳統(tǒng)所培育的技術實力,。
到那時為止．人們還不知道連接L－氨基酸的酶,，但知道把作為氨基酸中一種的D—丙氨酸連接起來生成二肽的酶,。于是可以推測，如果說存在連接L—氨基酸的酶,，就應該與D-丙氨酸連接酶的氨基酸序列相似,。
但是，只有這些還是不夠的,。為了進一步縮小候選范圍,，協(xié)和發(fā)酵設定了獨自的標準。由于還沒有發(fā)現(xiàn)從L氨基酸合成二肽的酶,，把功能已經(jīng)清楚了的基因序列排除在外,。另外，在二肽生成反應中需要能量,，那么二肽合成酶就必須存在生物體能量腺苷三磷酸(ATP)的結合區(qū)序列,。
此外，多肽合成酶比按順序把多肽連接起來的酶的分子量小,，這也作為一個檢索的條件,。氨基酸是比多肽小的分子,，所以連接氨基酸的酶也應該比連接多肽的酶小,。
檢索多個微生物基因組的結果表明，滿足這些條件的酶,，即具有連接L-氨基酸生成二肽活性的酶的基因,，可以作為候選者。當將候選者之一枯草桿菌來源的酶的基因?qū)氲酱竽c桿菌時,；就成功地合成了二肽,。多年的課題就在一瞬間獲得了解決。
顯示出in silico的通用性 已經(jīng)取得了分離基因的實績
實際上,，二肽合成酶并不是協(xié)和發(fā)酵in silico篩選方法的第一個成果,。2004年3月發(fā)表的重組普伐他汀的生產(chǎn)技術的開發(fā)也應用了這一技術。
普伐他汀是三共株式會社以“美巴羅汀”的商品名銷售的高脂血癥治療藥的化合物名稱,。由于普伐他汀的物質(zhì)專利已經(jīng)過期,，所以作為后發(fā)醫(yī)藥品銷售。但是,，三共所開發(fā)的普伐他汀制造方法的專利尚未到期,。因此，這就要求開發(fā)成本較低的替代方法,。
在這種情況下,，協(xié)和發(fā)酵制定了開發(fā)高效生產(chǎn)普伐他汀方法的目標。最早,，該公司在普伐他汀的前體物質(zhì)昆帕克汀的存在下培養(yǎng)各種細菌,，結果發(fā)現(xiàn)包含枯草桿菌在內(nèi)的多數(shù)Bacillus屬細菌可使昆帕克汀發(fā)生羥基化作用,。但是，沒有能夠分離出與反應有關的酶,。
為此,，協(xié)和發(fā)酵在破譯的枯草桿菌基因組信息基礎上進行in silico篩選。根據(jù)觀察到的具有使昆帕克汀羥基化活性的P450單氧化酶的氨基酸序列,，檢索了基因組數(shù)據(jù)庫,。在所發(fā)現(xiàn)的7個候選基因中，功能不明的基因yjiB具有使昆帕克汀羥基化的酶活性,。
同時,，普伐他汀的制法開發(fā)是一個例子，它表明使用基因組信息這一新的工具與至今所積累的微生物學知識相結合可以創(chuàng)造出具有競爭力的產(chǎn)品,。
為戰(zhàn)勝國外企業(yè)而充分利用 發(fā)酵科學和基因組信息
丙谷酰胺的事例表明,，利用生物技術的物質(zhì)生產(chǎn)，成本低且具有開拓新市場的能力,。但是,，生物法本身也存在自己的問題。作為物質(zhì)生產(chǎn)催化劑使用的酶和生產(chǎn)酶所需的微生物,，必須從某個地方獲得,。而且，物質(zhì)生產(chǎn)所需的反應是否本來就在微生物中進行,，在很多情況下并不明了,。
迄今為止，日本已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多新的微生物反應,，在生物工藝的開發(fā)方面走在了世界的前面,。能夠做到這一點的是那些堅持不懈地探索生物反應．并將其推向工業(yè)化的眾多研究人員。篩選微生物和酶的技術依然是必不可少的工具,。但是,，如本文開頭的例子所示，產(chǎn)業(yè)界的競爭正在加劇,，特別是亞洲各國的急起直追,，形勢相當嚴峻。
這個二肽生產(chǎn)的事例,，正是精通發(fā)酵技術的企業(yè)掌握基因組信息這一新式武器,，不卷入成本競爭中去而是開辟新市場的首例。
附文1：
生物法的開發(fā)使丙谷酰胺的價格減半,，使得丙谷酰胺擴大了在輸液,、培養(yǎng)基以及食品領域中的用途
兩家公司相繼發(fā)表的使用微生物方法制造的二肽，不僅顯示出與單獨的氨基酸不同的物性，他們還期待著它能夠具有各種各樣的生理活性,。例如,，3個氨基酸連接起來的三肽，有的就具有降壓作用,。實際上,，氨基酸連接得越多，就越可能出現(xiàn)新的功能,。
兩家公司都計劃首先將醫(yī)療界翹首以待的丙谷酰胺投放市場,。丙谷酰胺在體內(nèi)分解時，變?yōu)橄赖臓I養(yǎng)源——谷氨酰胺,。為了給因手術等無法進食的患者補充營養(yǎng),，以外科醫(yī)生為中心，添加丙谷酰胺的液需求量非常大,。但是,，由于價格的限制，加入丙谷酰胺的輸液尚未在日本國內(nèi)銷售,。
味之素氨基酸部的馬渡一德先生關于使用微生物的新方法對丙谷酰胺價格的影響問題認為：“價格因用途而改變,，大體上1kg為4萬～5萬日元．看來可以降到一半左右。”
原來味之素所考慮的丙谷酰胺的用途并不僅僅是輸液,。由于成本降低,，丙谷酰胺可以作為至今為止沒有能夠使用過的細胞培養(yǎng)基添加物加以利用了。據(jù)說味之素已經(jīng)開始向國外的生物醫(yī)藥品企業(yè)等供應樣品,。聽說將丙谷酰胺加入培養(yǎng)基中時,，可以延長細胞的壽命,、增加蛋白質(zhì)的產(chǎn)量等?，F(xiàn)在，以治療用抗體為首的蛋白質(zhì)醫(yī)藥品很多利用培養(yǎng)細胞生產(chǎn),，急需提高生產(chǎn)的效率,，該公司認為丙谷酰胺可以在這方面發(fā)揮作用。
開發(fā)丙谷酰胺食品方面的用途也令人感興趣,，但從來沒有作為食品使用的丙谷酰胺要作為食品使用,，存在著必須跨越的法規(guī)門檻。該公司的方針是首先開發(fā)在醫(yī)藥領域中的用途,。但是,，根據(jù)味之素的說法，由于分解蛋白質(zhì)而制造出來的多肽有苦味等,，作為營養(yǎng)成分加入食品中存在不少問題,，而丙谷酰胺是無味的，因此可以不影響食品的味道而容易添加，將來很可能利用在食品中,。
馬渡先生指出,，開發(fā)出丙谷酰胺的生產(chǎn)技術之后，“醫(yī)藥品企業(yè)紛紛前來咨詢是否能夠利用微生物制造其他的二肽”,。由于味乏素的生產(chǎn)方法可以應用于各種各樣的二肽生產(chǎn),，可以期待將來有可能利用于生產(chǎn)多肽醫(yī)藥品。
協(xié)和發(fā)酵也計劃首先確實向醫(yī)藥產(chǎn)品制造商銷售輸液用丙谷酰胺,。該公司的下一個目標是開發(fā)經(jīng)腸營養(yǎng)劑等醫(yī)療食品方面的應用,。如能夠進一步用作保健食品和飲料添加劑，則市場將更為巨大,。該公司也把目光投向丙谷酰胺以外的二肽上,。協(xié)和發(fā)酵正在追求的目標是生產(chǎn)具有呈味性、降低血壓效果和鎮(zhèn)痛效果等二肽的廣泛可能性,。
附文2：
味之素的丙谷酰胺生產(chǎn)方法是20年努力的成果,詳盡掌握微生物知識的研究人員們充分發(fā)揮了其技術能力
味之素開發(fā)的丙谷酰胺的工業(yè)生產(chǎn)方法,，是多年來從事發(fā)酵產(chǎn)業(yè)所積累的味之素的歷史和經(jīng)驗開花結果的好事例。
開發(fā)丙谷酰胺生產(chǎn)方法的是味之素國外食品氨基酸公司的氨基科學研究所,。該研究所的橫關健三理事小組,，首先研究了應該使微生物介入什么反應。以通用性高的方法等為由,，選擇了利用酯轉(zhuǎn)移酶把氨基酸甲酯和氨基酸連接起來的方法,。
其后，將1萬株左右的微生物作為篩選對象,，尋找合適的酶,。這種酶，是在開始研究時沒有發(fā)現(xiàn)過的酶,。研究組僅僅依靠在液體色譜圖上發(fā)現(xiàn)的極微小的峰,，由此而選出了產(chǎn)生酯轉(zhuǎn)移酶的菌株，最大限度地利用了在抑制蛋白質(zhì)水解酶,、調(diào)節(jié)溫度和pH值等條件方面的技術訣竅,，終于選出了候選的菌種。從菌體中精制出所發(fā)現(xiàn)的酶,，確認了它的活性,。
實際上，為了制造丙谷酰胺要使用大量表達所需酶的菌株,。據(jù)說合成二肽時便用精制的酶,，也可以使用休止菌體中的酶。似乎是把制造藥品等要求達到極限高純度的產(chǎn)品和非此類產(chǎn)品的制造分開處理的,。通過甲酯化反應,，可以決定產(chǎn)物肽的N端氨基酸和C端氨基酸，垂本上沒有副產(chǎn)物，這是關鍵,。
橫關理事說：“對于用無保護狀態(tài)的氨基酸合成二肽這種方法,，我持續(xù)考慮了20多年。”其間,，他還與公司內(nèi)部開發(fā)二肽化學合成法的其他研究組進行競爭,。味之素也開發(fā)了化學合成法，但最終因成本問題而采用了生物法,。
橫關理事回顧數(shù)年前的情況時說到,，開發(fā)丙谷酰胺的生物生產(chǎn)方法成功之時，對于市場前景的光明及其方向的正確非常高興,。雖然歷經(jīng)了艱辛,，但確定目標物質(zhì)后的研究進展迅速。研究組在開始開發(fā)工作的2001年,，就申請并獲得了該法的第一個專利,。
