宋麟祥
(工研院生醫(yī)中心生醫(yī)材料暨組織/工程技術(shù)組研究員)
■一,、前言
組織工程是生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域中一個(gè)快速發(fā)展的分支，它融合了細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理,，目的在開發(fā)具生物活性的組織替代物,，期能修復(fù)受損組織或是再生。由于組織工程對象是人體組織,，細(xì)胞和組織塊之體外培養(yǎng)條件必須仿生地接近人體內(nèi)環(huán)境,，因此生物反應(yīng)器即為良好的應(yīng)用工具，除在種子細(xì)胞增殖,、組織塊建構(gòu)培養(yǎng)扮演重要角色外,，生物反應(yīng)器尚能控制pH、溶氧,、機(jī)械應(yīng)力,、營養(yǎng)供給及代謝物移除等條件，為細(xì)胞的生長,、分化和發(fā)育分化提供最適宜的環(huán)境,。本文將介紹組織工程生物反應(yīng)器的應(yīng)用進(jìn)展與開發(fā)前景。
■二,、種子細(xì)胞,、組織塊與生物反應(yīng)器
(一)種子細(xì)胞擴(kuò)增
使用組織工程種子細(xì)胞須考慮三個(gè)重點(diǎn)：(1)適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度(即單位體積所需細(xì)胞數(shù)量),。Goshima等(1)將體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,，按不同密度復(fù)合于多孔陶瓷植入體內(nèi)，結(jié)果顯示植入物的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞密度須在2×107/cm3以上才能確保新骨形成,。另外,，當(dāng)軟骨細(xì)胞植入的密度低于1×107/cm3個(gè)時(shí),，會產(chǎn)生很少軟骨或軟骨無法生成(2)，可見種子細(xì)胞密度對培養(yǎng)的影響性,。(2)良好的種子細(xì)胞分化程度,。單層培養(yǎng)造成細(xì)胞去分化,，并容易形成細(xì)胞團(tuán)，造成細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榧?xì)長,，不具備塊狀組織的生理特征,，產(chǎn)生的ECM量少且質(zhì)量差。雖然培養(yǎng)在三維支架后,，細(xì)胞分化狀態(tài)可部分恢復(fù),，但往往恢復(fù)不完全，因而直接影響組織塊的質(zhì)量(3),。(3)控制種子細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)條件,。如神經(jīng)干細(xì)胞可以在微重力條件下，維持圓形的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行擴(kuò)增,。種子細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的關(guān)鍵問題,，在于控制生長條件(如溶氧濃度及pH值)及足量的營養(yǎng)供給(4)。
(二)利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)組織塊
人體細(xì)胞仿生性地生長在三維支架(載體)中,，除了比二維培養(yǎng)大幅增加細(xì)胞貼附的表面積外，也增加了生長因子供給效率和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM, extra cellular matrix)的合成量,，有利于細(xì)胞朝多方向遷移,、分化和大量增殖(5,6),。
另外,，三維多孔結(jié)構(gòu)也有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸,、代謝產(chǎn)物的排出,，以及保持載體內(nèi)部細(xì)胞旺盛的代謝活性(7),。 單層細(xì)胞平盤培養(yǎng)之營養(yǎng)來源一般不受限制,，這是因?yàn)橐蕾嚑I養(yǎng)液的擴(kuò)散,，足以通過單層細(xì)胞10μm左右的厚度,，但是當(dāng)組織塊的厚度超過100~200μm時(shí),，氧氣和營養(yǎng)的擴(kuò)散就會受到明顯限制,。實(shí)際上患者的組織或器官缺損的體積，往往遠(yuǎn)超過這個(gè)門坎,，平盤培養(yǎng)既然無法有效率提供足量的種子細(xì)胞,，便突顯出生物反應(yīng)器的重要性,。它提供的動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境使其內(nèi)部培養(yǎng)液流動，并使支架內(nèi)的氧及營養(yǎng)質(zhì)傳更充分,，更利于代謝廢物排出,，并能使細(xì)胞分布更均勻，細(xì)胞基質(zhì)分泌更多,，細(xì)胞表型表達(dá)更充分(8,9),。
Freed等(10)利用生物反應(yīng)器，在直徑6.7mm,、厚5mm的支架材料上培養(yǎng)出軟骨組織塊,，II型膠原蛋白的含量占總膠原蛋白量的9%以上。Hoerstrup等(11)利用脈動生物反應(yīng)器培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三尖瓣組織,，其結(jié)構(gòu)與機(jī)械性能亦接近人體三尖瓣,。
■三、組織工程生物反應(yīng)器的進(jìn)展
(一)組織工程對生物反應(yīng)器的要求
動物細(xì)胞尺寸在10~30mm之間,，比增殖速率較慢(約0.06hr-1),，倍增時(shí)間長(約12hr)。以生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞密度為106個(gè)/mL(約0.3g/L),，較高細(xì)胞密度為108個(gè)/mL(約30g/L),。細(xì)胞的耗氧量較大[約0.3mmol/(L×hr)]，其最大值可達(dá)到30mmol/(L×hr),。組織工程生物反應(yīng)器的培養(yǎng)參數(shù),，除了配合前述細(xì)胞的特性及需求外，須滿足以下的基本要求：生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)應(yīng)方便于培養(yǎng)液的均勻混合,，并提供精確的控制,，使各營養(yǎng)成分和培養(yǎng)液的pH值梯度盡量減少，此動態(tài)培養(yǎng)的方式乃為了使支架(即組織塊)內(nèi)的氧及營養(yǎng)質(zhì)傳更充分,，代謝產(chǎn)物更容易排出,，細(xì)胞表型更充分地表達(dá),。培養(yǎng)液混合方式應(yīng)使剪應(yīng)力對細(xì)胞的損傷降到最低。若為干細(xì)胞分化之大量培養(yǎng),，必須注意精準(zhǔn)控制干細(xì)胞在不同的分化階段所需不同的生長因子濃度,。生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)要能接近體內(nèi)發(fā)育情況，而體內(nèi)各種組織和器官所處環(huán)境各異,，某些種類細(xì)胞要求反應(yīng)器能提供一定的機(jī)械應(yīng)力,，如肌腱在體內(nèi)主要承受張應(yīng)力，而骨骼主要承擔(dān)壓應(yīng)力,，心血管主要承受脈動式應(yīng)力,，其它可能的物理影響因子尚有磁場、電場等,。因此,，生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)必須能因應(yīng)不同組織，提供「專一性」的需求,。此外,，為滿足較大體積組織建構(gòu)對種子細(xì)胞數(shù)量的需求，常將生物反應(yīng)器與微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合,。由于微載體有較大的比表面積,，相同容積的生物反應(yīng)器比普通培養(yǎng)方式，多出數(shù)十倍甚至上百倍的細(xì)胞,。微載體培養(yǎng)細(xì)胞可減少細(xì)胞去分化現(xiàn)象,，有利于細(xì)胞表型的維持，提高種子細(xì)胞的質(zhì)量,。因此,，生物反應(yīng)器還需要保持種子細(xì)胞與微載體在培養(yǎng)過程中良好的結(jié)合。盡管對組織工程反應(yīng)器有上述苛刻的要求,，現(xiàn)階段使用的反應(yīng)器,，大部分是在既有動物細(xì)胞反應(yīng)器上作少部分的改進(jìn)，雖然基本上能符合培養(yǎng)需求,，但由于專一性不強(qiáng)，甚至存在很多問題,，因此生物反應(yīng)器在組織工程領(lǐng)域還有很大的創(chuàng)新和發(fā)展空間,。
(二)組織工程的生物反應(yīng)器種類
(a)攪拌式生物反應(yīng)器
攪拌式生物反應(yīng)器(spinner flask bioreactors) 應(yīng)用于微載體細(xì)胞培養(yǎng)，以及軟骨和皮膚等組織培養(yǎng),。其主要原理是通過槳式攪拌器來攪動培養(yǎng)液,，以增加質(zhì)傳效果，確保培養(yǎng)液的養(yǎng)分和溶氧濃度的均勻分布,，達(dá)到大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的目的,。和其它生物反應(yīng)器相較,，其結(jié)構(gòu)簡單、成本較低,。組織塊培養(yǎng)時(shí),，把已完成種植細(xì)胞的支架懸吊在瓶塞上，使其浸沒在培養(yǎng)液中培養(yǎng),。在接種階段,，細(xì)胞藉由流體對流，將細(xì)胞運(yùn)送至支架貼附,。在培養(yǎng)過程中,，培養(yǎng)液因攪拌的帶動，使組織塊表面的流體保持交換狀態(tài),。培養(yǎng)液每隔數(shù)天更換一次,，以確保營養(yǎng)物質(zhì)的濃度并移除細(xì)胞代謝廢物(13)。
攪拌式生物反應(yīng)器的缺點(diǎn)是攪拌產(chǎn)生的剪應(yīng)力會對細(xì)胞造成不利的影響,。為了更加符合組織工程的要求,，許多改良產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，如美國NBS(New Brunswick Scientific)公司的單層籃式通氣攪拌器,。Kamen等人(14)的帶狀螺旋槳,，分別從通氣裝置和攪拌器上改進(jìn)，克服了剪應(yīng)力過大,、易產(chǎn)生氣泡等不利細(xì)胞的因素,。徐小增等(15)在攪拌器罩上一個(gè)帶夾套的筒體，使培養(yǎng)液流動平穩(wěn)且規(guī)律,，并搭配微孔透氣供氧系統(tǒng),，避免大氣泡的產(chǎn)生。以上因素都是攪拌式生物反應(yīng)器必須改進(jìn)的方向,。
(b)滾筒式生物反應(yīng)器(rotating-wall vessels)
滾筒式生物反應(yīng)器是目前組織工程領(lǐng)域最為廣泛應(yīng)用的生物反應(yīng)器,，一般可應(yīng)用在心血管、軟骨等細(xì)胞培養(yǎng),。1990年Kleis等人首先設(shè)計(jì)使用該型生物反應(yīng)器,，隨后美國國家太空總署(NASA)應(yīng)用到組織工程領(lǐng)域。其主要特點(diǎn)是培養(yǎng)液和組織塊在反應(yīng)器動力帶動下,，繞水平軸或垂直軸旋轉(zhuǎn)(16,17),，通過氣液兩相界面進(jìn)行氣體交換，并以無菌注射器換液來補(bǔ)充養(yǎng)分,。轉(zhuǎn)動中的反應(yīng)器對組織塊產(chǎn)生了拖曳力(Fd),、離心力(Fc)，以及重力(Fg)等，調(diào)節(jié)反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速,，使旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力剛好和細(xì)胞與微載體或支架的重力互相平衡,，即可使組織塊隨反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)懸浮于培養(yǎng)液中，而不致掉落碰壁,，故該反應(yīng)器提供了動態(tài)培養(yǎng)的環(huán)境,、低剪應(yīng)力和高的質(zhì)傳速率(18~20)。Gao等(21,22)對滾筒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的微載體運(yùn)動進(jìn)行數(shù)值分析,，當(dāng)微載體顆粒的密度大于培養(yǎng)基密度時(shí),，顆粒會向筒壁遷移，并撞擊壁面,。滾筒式生物反應(yīng)器很少能在線供液,，且難以工業(yè)規(guī)模化,，其發(fā)展受到限制,。如加入灌流，改進(jìn)在線供液,，對其內(nèi)部環(huán)境和成分進(jìn)行精確控制,，是此生物反應(yīng)器的改良方向。
(c)中空纖維生物反應(yīng)器
中空纖維生物反應(yīng)器(hollow-fiber bioreactors)為一特制的圓筒,，里面封裝著數(shù)千根中空纖維,，屬于一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，類似于動物的毛細(xì)血管,，管壁是極薄的半透膜,，作為細(xì)胞生長貼附及養(yǎng)分傳遞的界面(23)。當(dāng)培養(yǎng)液由管束中流過,，液體中比孔洞小的養(yǎng)份會穿出中空纖維管束薄膜,，供應(yīng)管外貼附的細(xì)胞。細(xì)胞代謝產(chǎn)物則會擴(kuò)散進(jìn)入纖維管束薄膜內(nèi),，隨培養(yǎng)液流出細(xì)胞所在的纖維管束,。系統(tǒng)可于37℃培養(yǎng)箱操作，其缺點(diǎn)是細(xì)胞種植時(shí)會較不均勻,，培養(yǎng)液進(jìn)入端之細(xì)胞會較多,，同時(shí)營養(yǎng)成分也會由培養(yǎng)液進(jìn)入端至出口端形成遞減的梯度。放大產(chǎn)程時(shí),，通常使用一個(gè)操作臺控制很多支中空纖維束,，該反應(yīng)器適合培養(yǎng)高代謝率及對培養(yǎng)環(huán)境較敏感的細(xì)胞，如肝,、腎等細(xì)胞。目前此類反應(yīng)器已作為人工肝臨床應(yīng)用,。
Kuk等(24)利用中空纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞,，細(xì)胞密度達(dá)108~109cells/ml,，和其它類型反應(yīng)器相比增加近50倍。在一般中低細(xì)胞密度培養(yǎng)時(shí),，對氧濃度要求不高,，在反應(yīng)器中大部分僅藉由膜自由擴(kuò)散達(dá)到質(zhì)傳目的。但在高密度培養(yǎng)時(shí),，供氧即不一定足夠,。Karel(25)、Piret和Cooney等人(26)研究顯示,，利用中空纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)高密度哺乳動物細(xì)胞時(shí),，在離纖維管表面100~200mm處有細(xì)胞壞死區(qū)。因此,，加上脈動流形成對流傳遞是一種重要的方法,。Efthymiou和Shuler(27) 研發(fā)的反應(yīng)器，是利用周期性的方式,，使細(xì)胞交替與培養(yǎng)基和空氣接觸,，大幅降低氣液兩相營養(yǎng)的質(zhì)傳限制，此為本反應(yīng)器目前的發(fā)展方向,。
(d)灌流生物反應(yīng)器
灌流生物反應(yīng)器(perfusion bioreactors)原理為連續(xù)添加培養(yǎng)液至培養(yǎng)槽,，同時(shí)也吸出相同體積的原有培養(yǎng)液，使槽內(nèi)培養(yǎng)液體積維持一定,，養(yǎng)分也能維持在細(xì)胞生長所需范圍以上,，細(xì)胞代謝產(chǎn)物則不會堆積太多。培養(yǎng)時(shí)將已完成種植細(xì)胞的支架懸吊于灌流系統(tǒng)中,，培養(yǎng)基直接流過支架之孔隙,，流體可在支架的截面均勻分布，讓接種的細(xì)胞隨之均勻注入多孔支架中貼附培養(yǎng),。灌流可以是開放式,，由系統(tǒng)中完全清除更換培養(yǎng)液；也可以是密閉系統(tǒng),，經(jīng)由另一個(gè)培養(yǎng)液容器再循環(huán)回到原先之培養(yǎng)槽,。此外，灌流反應(yīng)器克服了機(jī)械混合產(chǎn)生的剪應(yīng)力,，且因?yàn)榕囵B(yǎng)液吸出時(shí)不含有細(xì)胞,，細(xì)胞的密度會逐步增加到相當(dāng)高的密度。若對細(xì)胞的周圍環(huán)境包括pH值,、溫度,、培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分、代謝產(chǎn)物等，作精確的監(jiān)測和控制,，培養(yǎng)細(xì)胞的密度及質(zhì)量可以提高(28,29),。此類反應(yīng)器常用于培養(yǎng)骨骼組織。
(e)施加機(jī)械力的反應(yīng)器(bioreactors with mechanical force)
體內(nèi)三維組織結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞在生長時(shí)受多種力學(xué)刺激,，其中應(yīng)力的作用對組織的結(jié)構(gòu),、形態(tài)和功能產(chǎn)生明顯的影響(30,31)。關(guān)節(jié)軟骨在體內(nèi)正常生理狀態(tài)下承受著間歇性組織液體壓力,，羅鼣J白多醣的合成有影響(32),。Banes等于1985年設(shè)計(jì)以真空負(fù)壓控制牽引力的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。Segurola等(33)用鼠骨骼肌細(xì)胞在應(yīng)力作用下培養(yǎng),，發(fā)現(xiàn)中等水平的應(yīng)力(1~12%),，其誘導(dǎo)細(xì)胞排列沿張應(yīng)力方向；較大的應(yīng)力(12~24%),，則誘導(dǎo)細(xì)胞排列延垂直于張應(yīng)力方向,。施加機(jī)械力的反應(yīng)器，可設(shè)計(jì)周期性地對組織塊施加應(yīng)力,，施力的大小可以控制,，如為肌腱或韌帶組織設(shè)計(jì)，可提供張力條件的反應(yīng)器(34),。
此外,，尚可在組織工程生物反應(yīng)器外加電磁場(electromagnetic field)、脈動,、沖擊波(shock wave),。電磁場不僅可促進(jìn)骨的再生和骨細(xì)胞的增殖，還可促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌IGF-Ⅱ,、BMP-2,、TGF-β等生長因子和合成細(xì)胞外基質(zhì)(35)。一般使用之電場強(qiáng)度為10~100mA/m2,，頻率小于1kHz,，以提供脈動的反應(yīng)器建構(gòu)心臟瓣膜、人工血管等(36),。Wang等(37)用能量密度為0.16mJ/mm2的沖擊波(損傷細(xì)胞膜而不致?lián)p傷細(xì)胞器)作用于軟骨基質(zhì)細(xì)胞,，可使細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性增高,、膠原蛋白及骨鈣蛋白的合成增加,。表一為不同類型生物反應(yīng)器之性能比較。
■四,、生物反應(yīng)器的組織工程應(yīng)用
組織工程生物反應(yīng)器的開發(fā),，從取出組織塊,、分離細(xì)胞、擴(kuò)增到放大培養(yǎng)過程,，皆采自動化及個(gè)人化量身訂作方式,。組織工程之醫(yī)療愿景如圖二(12)，其步驟分述如下：
(a)外科醫(yī)師取出受診者的部分組織塊,，隨即引進(jìn)生物反應(yīng)器培養(yǎng)；
(b)培養(yǎng)基,、營養(yǎng)添加物,、立體支架等生物反應(yīng)器相關(guān)用品已預(yù)先配置，并儲存在良好的溫濕度控制室,；
(c)細(xì)胞在反應(yīng)器中與組織塊分離,；
(d)細(xì)胞在反應(yīng)器中擴(kuò)增；
(e)擴(kuò)增的細(xì)胞與立體支架結(jié)合,；
(f)持續(xù)培養(yǎng)直到新的組織塊形成,；
(g)培養(yǎng)過程中，生物反應(yīng)器參數(shù)及環(huán)境的變量受到嚴(yán)密監(jiān)測,；
(h)配合個(gè)別受診者的臨床紀(jì)錄,；
(i)微處理器自動以最適參數(shù)調(diào)控反應(yīng)器；
(j)外科醫(yī)師判讀培養(yǎng)組織的監(jiān)控信息,，并決定受診者最佳的植入時(shí)機(jī),。
組織工程產(chǎn)品需要大量種子細(xì)胞以建構(gòu)組織塊，如何從少量組織藉由生物反應(yīng)器獲取,，已成為組織工程研究迫切需要解決的問題之一,。目前常使用的貼壁培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)，系屬二維方式生長,，并非人體中的立體形態(tài),。組織工程要求三維結(jié)構(gòu)的組織塊培養(yǎng)，且不同類的細(xì)胞培養(yǎng)后,，要能維持其不同的分化與功能,。由于培養(yǎng)組織塊時(shí)，往往無法及時(shí)供應(yīng)其內(nèi)部細(xì)胞足夠的營養(yǎng)及適當(dāng)濃度的細(xì)胞因子,，且培養(yǎng)過程的代謝產(chǎn)物亦無法迅速排出,，導(dǎo)致其生長緩慢甚至死亡。另外,，除了甚少的報(bào)導(dǎo)外(38),，通常一次僅能針對一種細(xì)胞培養(yǎng)，也限制了組織塊仿生的程度,。目前僅有軟骨產(chǎn)品和皮膚移植進(jìn)入實(shí)用階段,，而內(nèi)臟組織塊甚至器官培養(yǎng),，其技術(shù)上仍存在上述問題。
各類型生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)必須能仿生性地接近體內(nèi)環(huán)境,，其功能和結(jié)構(gòu)上將更趨復(fù)雜,，并朝向自動化、多功能化,、高效率和多樣化發(fā)展,，期能因應(yīng)各種組織，精準(zhǔn)調(diào)控生長因子與激素的釋放,，穩(wěn)定控制生物反應(yīng)器內(nèi)部溫度,、pH值及氣體分壓等參數(shù)，又能視需要對培養(yǎng)的組織施加物理參數(shù),，如磁場,、電場、應(yīng)力場等,。未來,，生物反應(yīng)器在組織工程的應(yīng)用將對人類提供更多更大的幫助。
反應(yīng)器種類 剪應(yīng)力 質(zhì)傳 適用組織種類 可提供的培養(yǎng)方式
攪拌式 大 強(qiáng) 皮膚,、軟骨 貼壁,、懸浮、微載體
滾筒式 很小 弱 心血管,、軟骨 懸浮,、微載體、三維支架材料
中空纖維式 小 中等 胰島,、肝,、腎細(xì)胞 貼壁、懸浮,、微載體,、三維支架材料、中空纖維管
灌流式 中等 強(qiáng) 骨骼組織 懸浮,、微載體,、三維支架材料
施加機(jī)械力式 較大 中等 軟骨組織 三維支架材料
表一 組織工程生物反應(yīng)器性能比較
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