宋麟祥
(工研院生醫(yī)中心生醫(yī)材料暨組織/工程技術(shù)組研究員)
■一、前言
組織工程是生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域中一個快速發(fā)展的分支,，它融合了細胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理,，目的在開發(fā)具生物活性的組織替代物，期能修復(fù)受損組織或是再生,。由于組織工程對象是人體組織,，細胞和組織塊之體外培養(yǎng)條件必須仿生地接近人體內(nèi)環(huán)境，因此生物反應(yīng)器即為良好的應(yīng)用工具,，除在種子細胞增殖,、組織塊建構(gòu)培養(yǎng)扮演重要角色外，生物反應(yīng)器尚能控制pH,、溶氧,、機械應(yīng)力、營養(yǎng)供給及代謝物移除等條件,，為細胞的生長,、分化和發(fā)育分化提供最適宜的環(huán)境。本文將介紹組織工程生物反應(yīng)器的應(yīng)用進展與開發(fā)前景,。
■二,、種子細胞、組織塊與生物反應(yīng)器
(一)種子細胞擴增
使用組織工程種子細胞須考慮三個重點：(1)適當(dāng)?shù)募毎芏?即單位體積所需細胞數(shù)量)。Goshima等(1)將體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞,，按不同密度復(fù)合于多孔陶瓷植入體內(nèi),，結(jié)果顯示植入物的骨髓間充質(zhì)干細胞密度須在2×107/cm3以上才能確保新骨形成。另外,，當(dāng)軟骨細胞植入的密度低于1×107/cm3個時,，會產(chǎn)生很少軟骨或軟骨無法生成(2)，可見種子細胞密度對培養(yǎng)的影響性,。(2)良好的種子細胞分化程度,。單層培養(yǎng)造成細胞去分化，并容易形成細胞團,，造成細胞形態(tài)變?yōu)榧氶L,，不具備塊狀組織的生理特征，產(chǎn)生的ECM量少且質(zhì)量差,。雖然培養(yǎng)在三維支架后,，細胞分化狀態(tài)可部分恢復(fù)，但往往恢復(fù)不完全,，因而直接影響組織塊的質(zhì)量(3),。(3)控制種子細胞擴增培養(yǎng)條件。如神經(jīng)干細胞可以在微重力條件下,，維持圓形的細胞形態(tài)進行擴增,。種子細胞擴增培養(yǎng)的關(guān)鍵問題，在于控制生長條件(如溶氧濃度及pH值)及足量的營養(yǎng)供給(4),。
(二)利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)組織塊
人體細胞仿生性地生長在三維支架(載體)中,，除了比二維培養(yǎng)大幅增加細胞貼附的表面積外，也增加了生長因子供給效率和細胞外基質(zhì)(ECM, extra cellular matrix)的合成量,，有利于細胞朝多方向遷移,、分化和大量增殖(5,6)。
另外,，三維多孔結(jié)構(gòu)也有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸,、代謝產(chǎn)物的排出，以及保持載體內(nèi)部細胞旺盛的代謝活性(7),。 單層細胞平盤培養(yǎng)之營養(yǎng)來源一般不受限制,，這是因為依賴營養(yǎng)液的擴散，足以通過單層細胞10μm左右的厚度,，但是當(dāng)組織塊的厚度超過100~200μm時，氧氣和營養(yǎng)的擴散就會受到明顯限制,。實際上患者的組織或器官缺損的體積，往往遠超過這個門坎,，平盤培養(yǎng)既然無法有效率提供足量的種子細胞,，便突顯出生物反應(yīng)器的重要性,。它提供的動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境使其內(nèi)部培養(yǎng)液流動,，并使支架內(nèi)的氧及營養(yǎng)質(zhì)傳更充分,，更利于代謝廢物排出，并能使細胞分布更均勻,，細胞基質(zhì)分泌更多,，細胞表型表達更充分(8,9)。
Freed等(10)利用生物反應(yīng)器,，在直徑6.7mm,、厚5mm的支架材料上培養(yǎng)出軟骨組織塊，II型膠原蛋白的含量占總膠原蛋白量的9%以上,。Hoerstrup等(11)利用脈動生物反應(yīng)器培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的三尖瓣組織,，其結(jié)構(gòu)與機械性能亦接近人體三尖瓣。
■三,、組織工程生物反應(yīng)器的進展
(一)組織工程對生物反應(yīng)器的要求
動物細胞尺寸在10~30mm之間,，比增殖速率較慢(約0.06hr-1)，倍增時間長(約12hr),。以生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細胞密度為106個/mL(約0.3g/L),，較高細胞密度為108個/mL(約30g/L)。細胞的耗氧量較大[約0.3mmol/(L×hr)],，其最大值可達到30mmol/(L×hr)。組織工程生物反應(yīng)器的培養(yǎng)參數(shù),，除了配合前述細胞的特性及需求外,，須滿足以下的基本要求：生物反應(yīng)器的設(shè)計應(yīng)方便于培養(yǎng)液的均勻混合，并提供精確的控制,，使各營養(yǎng)成分和培養(yǎng)液的pH值梯度盡量減少,，此動態(tài)培養(yǎng)的方式乃為了使支架(即組織塊)內(nèi)的氧及營養(yǎng)質(zhì)傳更充分，代謝產(chǎn)物更容易排出,，細胞表型更充分地表達,。培養(yǎng)液混合方式應(yīng)使剪應(yīng)力對細胞的損傷降到最低。若為干細胞分化之大量培養(yǎng),，必須注意精準控制干細胞在不同的分化階段所需不同的生長因子濃度,。生物反應(yīng)器設(shè)計要能接近體內(nèi)發(fā)育情況,，而體內(nèi)各種組織和器官所處環(huán)境各異，某些種類細胞要求反應(yīng)器能提供一定的機械應(yīng)力,，如肌腱在體內(nèi)主要承受張應(yīng)力,，而骨骼主要承擔(dān)壓應(yīng)力，心血管主要承受脈動式應(yīng)力,，其它可能的物理影響因子尚有磁場,、電場等。因此,，生物反應(yīng)器的設(shè)計必須能因應(yīng)不同組織,，提供「專一性」的需求。此外,，為滿足較大體積組織建構(gòu)對種子細胞數(shù)量的需求,，常將生物反應(yīng)器與微載體細胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合。由于微載體有較大的比表面積,，相同容積的生物反應(yīng)器比普通培養(yǎng)方式,，多出數(shù)十倍甚至上百倍的細胞。微載體培養(yǎng)細胞可減少細胞去分化現(xiàn)象,，有利于細胞表型的維持,，提高種子細胞的質(zhì)量。因此,，生物反應(yīng)器還需要保持種子細胞與微載體在培養(yǎng)過程中良好的結(jié)合,。盡管對組織工程反應(yīng)器有上述苛刻的要求，現(xiàn)階段使用的反應(yīng)器,，大部分是在既有動物細胞反應(yīng)器上作少部分的改進,，雖然基本上能符合培養(yǎng)需求，但由于專一性不強,，甚至存在很多問題,，因此生物反應(yīng)器在組織工程領(lǐng)域還有很大的創(chuàng)新和發(fā)展空間。
(二)組織工程的生物反應(yīng)器種類
(a)攪拌式生物反應(yīng)器
攪拌式生物反應(yīng)器(spinner flask bioreactors) 應(yīng)用于微載體細胞培養(yǎng),，以及軟骨和皮膚等組織培養(yǎng),。其主要原理是通過槳式攪拌器來攪動培養(yǎng)液，以增加質(zhì)傳效果,，確保培養(yǎng)液的養(yǎng)分和溶氧濃度的均勻分布,，達到大規(guī)模培養(yǎng)細胞的目的。和其它生物反應(yīng)器相較,，其結(jié)構(gòu)簡單,、成本較低。組織塊培養(yǎng)時,，把已完成種植細胞的支架懸吊在瓶塞上,，使其浸沒在培養(yǎng)液中培養(yǎng),。在接種階段，細胞藉由流體對流,，將細胞運送至支架貼附,。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液因攪拌的帶動,，使組織塊表面的流體保持交換狀態(tài),。培養(yǎng)液每隔數(shù)天更換一次，以確保營養(yǎng)物質(zhì)的濃度并移除細胞代謝廢物(13),。
攪拌式生物反應(yīng)器的缺點是攪拌產(chǎn)生的剪應(yīng)力會對細胞造成不利的影響,。為了更加符合組織工程的要求，許多改良產(chǎn)品應(yīng)運而生,，如美國NBS(New Brunswick Scientific)公司的單層籃式通氣攪拌器,。Kamen等人(14)的帶狀螺旋槳，分別從通氣裝置和攪拌器上改進,，克服了剪應(yīng)力過大,、易產(chǎn)生氣泡等不利細胞的因素。徐小增等(15)在攪拌器罩上一個帶夾套的筒體,，使培養(yǎng)液流動平穩(wěn)且規(guī)律,，并搭配微孔透氣供氧系統(tǒng)，避免大氣泡的產(chǎn)生,。以上因素都是攪拌式生物反應(yīng)器必須改進的方向,。
(b)滾筒式生物反應(yīng)器(rotating-wall vessels)
滾筒式生物反應(yīng)器是目前組織工程領(lǐng)域最為廣泛應(yīng)用的生物反應(yīng)器，一般可應(yīng)用在心血管,、軟骨等細胞培養(yǎng),。1990年Kleis等人首先設(shè)計使用該型生物反應(yīng)器，隨后美國國家太空總署(NASA)應(yīng)用到組織工程領(lǐng)域,。其主要特點是培養(yǎng)液和組織塊在反應(yīng)器動力帶動下,，繞水平軸或垂直軸旋轉(zhuǎn)(16,17)，通過氣液兩相界面進行氣體交換,，并以無菌注射器換液來補充養(yǎng)分,。轉(zhuǎn)動中的反應(yīng)器對組織塊產(chǎn)生了拖曳力(Fd)、離心力(Fc),，以及重力(Fg)等，調(diào)節(jié)反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速,，使旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力剛好和細胞與微載體或支架的重力互相平衡,，即可使組織塊隨反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)懸浮于培養(yǎng)液中，而不致掉落碰壁,，故該反應(yīng)器提供了動態(tài)培養(yǎng)的環(huán)境,、低剪應(yīng)力和高的質(zhì)傳速率(18~20),。Gao等(21,22)對滾筒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的微載體運動進行數(shù)值分析，當(dāng)微載體顆粒的密度大于培養(yǎng)基密度時,，顆粒會向筒壁遷移,，并撞擊壁面。滾筒式生物反應(yīng)器很少能在線供液,，且難以工業(yè)規(guī)?；浒l(fā)展受到限制,。如加入灌流,，改進在線供液，對其內(nèi)部環(huán)境和成分進行精確控制,，是此生物反應(yīng)器的改良方向,。
(c)中空纖維生物反應(yīng)器
中空纖維生物反應(yīng)器(hollow-fiber bioreactors)為一特制的圓筒，里面封裝著數(shù)千根中空纖維,，屬于一種細微的管狀結(jié)構(gòu),，類似于動物的毛細血管，管壁是極薄的半透膜,，作為細胞生長貼附及養(yǎng)分傳遞的界面(23),。當(dāng)培養(yǎng)液由管束中流過，液體中比孔洞小的養(yǎng)份會穿出中空纖維管束薄膜,，供應(yīng)管外貼附的細胞,。細胞代謝產(chǎn)物則會擴散進入纖維管束薄膜內(nèi)，隨培養(yǎng)液流出細胞所在的纖維管束,。系統(tǒng)可于37℃培養(yǎng)箱操作,，其缺點是細胞種植時會較不均勻，培養(yǎng)液進入端之細胞會較多,，同時營養(yǎng)成分也會由培養(yǎng)液進入端至出口端形成遞減的梯度,。放大產(chǎn)程時，通常使用一個操作臺控制很多支中空纖維束,，該反應(yīng)器適合培養(yǎng)高代謝率及對培養(yǎng)環(huán)境較敏感的細胞,，如肝、腎等細胞,。目前此類反應(yīng)器已作為人工肝臨床應(yīng)用,。
Kuk等(24)利用中空纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)哺乳動物細胞，細胞密度達108~109cells/ml,，和其它類型反應(yīng)器相比增加近50倍,。在一般中低細胞密度培養(yǎng)時，對氧濃度要求不高,，在反應(yīng)器中大部分僅藉由膜自由擴散達到質(zhì)傳目的,。但在高密度培養(yǎng)時,，供氧即不一定足夠。Karel(25),、Piret和Cooney等人(26)研究顯示,，利用中空纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)高密度哺乳動物細胞時，在離纖維管表面100~200mm處有細胞壞死區(qū),。因此,，加上脈動流形成對流傳遞是一種重要的方法。Efthymiou和Shuler(27) 研發(fā)的反應(yīng)器,，是利用周期性的方式,，使細胞交替與培養(yǎng)基和空氣接觸，大幅降低氣液兩相營養(yǎng)的質(zhì)傳限制,，此為本反應(yīng)器目前的發(fā)展方向,。
(d)灌流生物反應(yīng)器
灌流生物反應(yīng)器(perfusion bioreactors)原理為連續(xù)添加培養(yǎng)液至培養(yǎng)槽，同時也吸出相同體積的原有培養(yǎng)液,，使槽內(nèi)培養(yǎng)液體積維持一定,，養(yǎng)分也能維持在細胞生長所需范圍以上，細胞代謝產(chǎn)物則不會堆積太多,。培養(yǎng)時將已完成種植細胞的支架懸吊于灌流系統(tǒng)中,，培養(yǎng)基直接流過支架之孔隙，流體可在支架的截面均勻分布,，讓接種的細胞隨之均勻注入多孔支架中貼附培養(yǎng),。灌流可以是開放式，由系統(tǒng)中完全清除更換培養(yǎng)液,；也可以是密閉系統(tǒng),，經(jīng)由另一個培養(yǎng)液容器再循環(huán)回到原先之培養(yǎng)槽。此外,，灌流反應(yīng)器克服了機械混合產(chǎn)生的剪應(yīng)力,，且因為培養(yǎng)液吸出時不含有細胞，細胞的密度會逐步增加到相當(dāng)高的密度,。若對細胞的周圍環(huán)境包括pH值,、溫度、培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分,、代謝產(chǎn)物等,，作精確的監(jiān)測和控制，培養(yǎng)細胞的密度及質(zhì)量可以提高(28,29),。此類反應(yīng)器常用于培養(yǎng)骨骼組織,。
(e)施加機械力的反應(yīng)器(bioreactors with mechanical force)
體內(nèi)三維組織結(jié)構(gòu)中的細胞在生長時受多種力學(xué)刺激，其中應(yīng)力的作用對組織的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能產(chǎn)生明顯的影響(30,31),。關(guān)節(jié)軟骨在體內(nèi)正常生理狀態(tài)下承受著間歇性組織液體壓力，羅鼣J白多醣的合成有影響(32),。Banes等于1985年設(shè)計以真空負壓控制牽引力的細胞培養(yǎng)裝置,。Segurola等(33)用鼠骨骼肌細胞在應(yīng)力作用下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)中等水平的應(yīng)力(1~12%),，其誘導(dǎo)細胞排列沿張應(yīng)力方向,；較大的應(yīng)力(12~24%)，則誘導(dǎo)細胞排列延垂直于張應(yīng)力方向,。施加機械力的反應(yīng)器,，可設(shè)計周期性地對組織塊施加應(yīng)力，施力的大小可以控制,，如為肌腱或韌帶組織設(shè)計,，可提供張力條件的反應(yīng)器(34)。
此外,，尚可在組織工程生物反應(yīng)器外加電磁場(electromagnetic field),、脈動、沖擊波(shock wave),。電磁場不僅可促進骨的再生和骨細胞的增殖,，還可促進成骨細胞分泌IGF-Ⅱ、BMP-2,、TGF-β等生長因子和合成細胞外基質(zhì)(35),。一般使用之電場強度為10~100mA/m2，頻率小于1kHz,，以提供脈動的反應(yīng)器建構(gòu)心臟瓣膜,、人工血管等(36)。Wang等(37)用能量密度為0.16mJ/mm2的沖擊波(損傷細胞膜而不致?lián)p傷細胞器)作用于軟骨基質(zhì)細胞,，可使細胞增殖,、堿性磷酸酶活性增高、膠原蛋白及骨鈣蛋白的合成增加,。表一為不同類型生物反應(yīng)器之性能比較,。
■四、生物反應(yīng)器的組織工程應(yīng)用
組織工程生物反應(yīng)器的開發(fā),，從取出組織塊,、分離細胞、擴增到放大培養(yǎng)過程,，皆采自動化及個人化量身訂作方式,。組織工程之醫(yī)療愿景如圖二(12)，其步驟分述如下：
(a)外科醫(yī)師取出受診者的部分組織塊，隨即引進生物反應(yīng)器培養(yǎng),；
(b)培養(yǎng)基,、營養(yǎng)添加物、立體支架等生物反應(yīng)器相關(guān)用品已預(yù)先配置,，并儲存在良好的溫濕度控制室,；
(c)細胞在反應(yīng)器中與組織塊分離；
(d)細胞在反應(yīng)器中擴增,；
(e)擴增的細胞與立體支架結(jié)合,；
(f)持續(xù)培養(yǎng)直到新的組織塊形成；
(g)培養(yǎng)過程中,，生物反應(yīng)器參數(shù)及環(huán)境的變量受到嚴密監(jiān)測,；
(h)配合個別受診者的臨床紀錄；
(i)微處理器自動以最適參數(shù)調(diào)控反應(yīng)器,；
(j)外科醫(yī)師判讀培養(yǎng)組織的監(jiān)控信息,，并決定受診者最佳的植入時機。
組織工程產(chǎn)品需要大量種子細胞以建構(gòu)組織塊,，如何從少量組織藉由生物反應(yīng)器獲取,，已成為組織工程研究迫切需要解決的問題之一。目前常使用的貼壁培養(yǎng)或微載體培養(yǎng),，系屬二維方式生長,，并非人體中的立體形態(tài)。組織工程要求三維結(jié)構(gòu)的組織塊培養(yǎng),，且不同類的細胞培養(yǎng)后,，要能維持其不同的分化與功能。由于培養(yǎng)組織塊時,，往往無法及時供應(yīng)其內(nèi)部細胞足夠的營養(yǎng)及適當(dāng)濃度的細胞因子,，且培養(yǎng)過程的代謝產(chǎn)物亦無法迅速排出，導(dǎo)致其生長緩慢甚至死亡,。另外,，除了甚少的報導(dǎo)外(38)，通常一次僅能針對一種細胞培養(yǎng),，也限制了組織塊仿生的程度,。目前僅有軟骨產(chǎn)品和皮膚移植進入實用階段，而內(nèi)臟組織塊甚至器官培養(yǎng),，其技術(shù)上仍存在上述問題,。
各類型生物反應(yīng)器設(shè)計必須能仿生性地接近體內(nèi)環(huán)境，其功能和結(jié)構(gòu)上將更趨復(fù)雜,，并朝向自動化,、多功能化、高效率和多樣化發(fā)展，期能因應(yīng)各種組織,，精準調(diào)控生長因子與激素的釋放,，穩(wěn)定控制生物反應(yīng)器內(nèi)部溫度、pH值及氣體分壓等參數(shù),，又能視需要對培養(yǎng)的組織施加物理參數(shù),，如磁場、電場,、應(yīng)力場等。未來,，生物反應(yīng)器在組織工程的應(yīng)用將對人類提供更多更大的幫助,。
反應(yīng)器種類 剪應(yīng)力 質(zhì)傳 適用組織種類 可提供的培養(yǎng)方式
攪拌式 大 強 皮膚、軟骨 貼壁,、懸浮,、微載體
滾筒式 很小 弱 心血管、軟骨 懸浮,、微載體,、三維支架材料
中空纖維式 小 中等 胰島、肝,、腎細胞 貼壁,、懸浮、微載體,、三維支架材料,、中空纖維管
灌流式 中等 強 骨骼組織 懸浮、微載體,、三維支架材料
施加機械力式 較大 中等 軟骨組織 三維支架材料
表一 組織工程生物反應(yīng)器性能比較
參考文獻
1.Goshima J, Coldberg VM, Caplan AI. (1991) The osteogenic potential of culture-expanded rat marrow mesenchymal cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks. Clin. Orthp. 262: 298-311.
2.James KR, Krishna GG. (2002) Tissue engineering with chondrocytes. Facial Plastic Surgery. 18(1): 59－68.
3.van Osch GJ, van der Veen SW, Verwoerd-Verhoef H. (2001) In vitro redifferentiation of culture-expanded rabbit and human auricular chondrocytes for cartilage reconstruction. Plast. Reconstr. Surg. 107(2): 433-440.
4.Kallos M S, Behie L A. (1999) Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 :473 - 483.
5.Shea LD, Wang D. Franceschi RT. (2000) Engineered bone development from a pre-osteoblast cell line on three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 6(6): 605-617.
6.Kinoshita S, Finnegan M, Bucholz RW. (1999) Three-dimensional collagen gel culture promotes osteoblastic phenotype in bone marrow derived cells. Kobe J. Med. Sci. 45 (5) :201-211.
7.Holy CE, Shoichet MS, Davies JE. (2000) Engineering three-dimensional bone tissue in vitro using biodegradable scaffolds :investigating initial cell-seeding density and culture period. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3) :376-382.
8.Botchwey EA, Pollack SR, Levine EM. (2001) Bone tissue engineering in a rotating bioreactor using a microcarrier matrix system. J. Biomed. Mater. Res. 55(2): 242-253.
9.Lu I, Zhu XM, Richard GV. (2001) Biodegradable polymer scaffold for cartilage tissue engineering. Clin. Orthp. 391(1) suppl: 251-270.
10.Freed LE, Hollander I, Martin. (1998) Chondrogenesis in a cell-polymer-bioreactor system. Exp. Cell. Res. 240: 58-65.
11.Hoerstrup SP, Kadner A, Melnitchouk S. (2002) Tissue engineering of functional trileaflet heart valves from human marrow stromal cells. Circulation. 9: 143-150.
12.Ivan M, David W, Michael H. (2004) The role of bioreactors in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 22: 80-86.
13.James KH, Krshna GG. (2002) Tissue engineering with chondrocytes. Facial Plastic Surgery. 18(1): 59-68.
14.Kamen AA, Charaie C, Andre G. (1992) Densign parameters and performance of a surface baffled helical ribbon impeller bio reactor for the culture of shear sensitive cells. Chemical Engineering Science. 47(9-11) : 2375-2380.
15.徐小增,、于國祥 (1996).實用新型細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器.CN 2236493Y[專利].
16.Kleis SJ, Schreck SA. (1990) Viscous pump bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 36: 771-777.
17.Muzzio FJ, Unger DR, Liu M. (1999) Computational and experimental investigation for flow and particle settling in a roller bottle bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 63 (2) : 185-196.
18.Begley CM, Kleis SJ. (2000) The fluid dynamic and shear environment in the NASA/J SC rotating-wall perfused-vessel bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 70(1) : 32-40.
19.Goodwin TJ, Prewett TL, Wolf DA. (1993) Reduced shear stress: a major component in the ability of mammalian tissues to form three-dimensional assemblies in simulated microgravity. J. Cell. Biochem. 51: 301-311.
20.Freed E, Langer R, Martin I. (1997) Tissue engineering of cartilage in space. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 13885-13890.
21.Gao H, Ayyaswamy PS, Duckeyne P. (2001) Surface transformation of bioactive glass in bioreactors simulating microgravity conditions. Part one: experimental study [ J ]. Biotechnol. Bioeng. 75(3): 369-378.
22.Gao H, Ayyaswamy PS, Duckeyne P. (2001) Surface transformation of bioactive glass in bioreactors simulating microgravity conditions. Part two: numerical simulations[J ]. Biotechnol.Bioeng. 75(3): 385.
23.Tyo MA, Bulbulian, BJ, Menken, BZ, Murphy, TJ. (1988). Large-scale mammalian cell culture utilizing Acusyst technology. In “Animal cell biotechnology”, Vol. 3 pp. 358-371.
24.KuK, Kuo MJ, Delente J. (1981) Development of the a hollow-fiber system for large-scale culture of mammalian cells. Biotechnol. Bioeng. 23: 79－95.
25.Karel SF, Libicki SB, Robertson CR. (1985) The immobilization of whole cells. Chem. Eng. Sci. 40: 1321-1354.
26.Piret JM , Cooney CL. (1991) Model of oxygen transport limitations in hollow fiber bioreactors [J ]. Biotechnol. Bioeng. 37: 80－92.
27.Efthymiou GS, Shuler ML. (1999) Elimination of diffusional limitation in a membrane entrapped cell reactor. Biotechnol. Bioeng. 62: 183-192.
28.Griffiths B. (2001) Scale-up of suspension and anchorage-dependent animal cells. Mol. Biotechnol. 7(3): 225-238.
29.Pathi P, Ma T, Locke BR. (2005) Role of nutrient supply on cell growth in bioreactor design for tissue engineering of hematopoietic cells. Biotechnol. Bioeng. 89(7): 743-758.
30.Slack C, Flint MH, Thompson BM. (1984) The effect of tensional load on isolated embryonic chick tendons in organ culture. Connect. Tissue Res. 12(3-4): 229-247.
31.Nishioka S, Fukuda K, Tanaka S. (1993) Cyclic stretch increases alkaline phosphatase activity of osteoblast-like cells : a role for prostaglandin E2. Bone Miner. 21(2): 141-150.
32.Parkkinen JJ, Lammi MJ, Inkinen R. (1995) Influence of short-term hydrostatic pressure on organization of stress fibers in cultured chondrocytes. J. Orthop. Res. 13(4): 495-502.
33.Segurola RJ Jr, Mills I, Sumpio BE. (1998) Strain-induced dual alignment of L6 rat skeletal muscle cells. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Anim. 34 (8): 609-612.
34.Vunjak-Novakovic G, Altman G, Horan R, Kaplan DL. (2004) Tissue engineering of ligaments. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6:131-156.
35.趙云山,張西正,郭勇. (2002) 電磁場對骨組織和成骨細胞的作用. 國外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊. 25(4): 169－173.
36.Niklason LE, Gao J, Abbott WM. (1999) Functional arteries grown in vivo. Science. 284: 489-493.
37.Wang FS ,Wang CJ ,Huang HJ. (2001) Physics shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells[J ] .Biochem. Biophys. Res. Commun. 287: 648-655.
38.Lichtenberg A, Dumlu G, Walles T, Maringka M, Ringes-Lichtenberg S, Ruhparwar A, Mertsching H, Haverich A. (2005) A multifunctional bioreactor for three-dimensional cell (co)-culture. Biomaterials. 26(5):555-562.
