禽流感病毒檢測技術的研究新進展
禽流感（ＡＩ）是由Ａ型流感病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）的感染和／或疾病綜合癥。禽流感病毒屬正黏病毒科流感病毒屬,，典型病毒粒子為球形,，直徑８０～１２０ｎｍ,，有時呈絲狀體等形態(tài)。至今已發(fā)現Ａ型流感病毒的血凝素（ＨＡ）有１６種,，神經氨酸酶（ＮＡ）有９種（傅生芳,，２００５）,，根據表面糖蛋白ＨＡ和ＮＡ的抗原性差異可以分為１６個ＨＡ亞型和９個ＮＡ亞型，不同亞型病毒之間可以通過交換某些基因片段發(fā)生基因重排,，出現具有新的生物學特征的病毒,，因此，ＡＩＶ 最顯著的生物學特征之一就是亞型眾多,。而且,，不同亞型或血清型之間無交叉反應性或反應性低，這使得禽流感的診斷監(jiān)測工作較為困難,。禽流感根據ＡＩＶ致病力的強弱可分為高致病性（ＨＰＡＩＶ）和低致病性（ＬＰＡＩＶ）,，前者不僅可以引起家禽死亡，還可以造成人的感染死亡,，因此,，控制ＡＩＶ的發(fā)生和流行具有重要意義。文章就禽流感近幾年的研究,，尤其是在病原學檢測,、免疫分
析方法和分子生物學檢測方法的研究進行了綜述。
１ 病原學檢測
１．１ 病毒的分離鑒定
ＡＩＶ 在雞胚中生長良好,，將疑似病料經適當處理接種在９～１０日齡的雞胚中,，分離培養(yǎng)病毒。若檢測出有凝血活性,，可進一步確定分型,；若無凝血活性，則認為未分離到病毒（趙翠燕等,，２００３）,，該方法具有精確、敏感的優(yōu)點,，但操作繁瑣,，耗時較長，需要１周左右的時間,。
１．２ 電鏡技術
利用電鏡技術可以直觀準確地鑒別病毒,，根據病毒自身的形態(tài)、結構等不同特征,，能很快做出診斷,。檢驗結果與樣品制備技術、收取病料的部位和時間有關,，電鏡法不能用于亞型及致病性的測定且其受到設備的限制，投入資金較大（劉志杰等,，２０１１）
２ 免疫分析技術
２．１ 免疫傳感技術
隨著生物傳感器的飛速發(fā)展,，出現了生物傳感器微陣列,、微系統(tǒng)，該技術靈敏度高,、響應快,，不需要標記，既可定性又可定量,，克服了傳統(tǒng)檢測方法費時,、昂貴、標記及操作繁瑣等缺點,，具有極廣泛的發(fā)展前景及臨床使用價值,，成為生物傳感器領域的研究熱點（姚春艷等，２００６）,。免疫識別膜的固定化技術是生物傳感器制作的核心部分,，其固定化技術決定著生物傳感器的選擇性、靈敏度,、穩(wěn)定性和壽命等主要性能,，也決定著生物傳感器是否有研究和應用價值。詹愛軍等（２００９）將石英晶片諧振的高靈敏度與免疫反應的特異性相結合,，用蛋白Ａ（ＳＰＡ）在鍍金膜的石英晶體電極偶聯抗Ｈ９亞型流感病毒的單抗構建傳感器探頭形成免疫傳感器,。檢測結果表明，該方法具有較好的特異性,，不與Ｈ５亞型禽流感病毒和新城疫病毒（ＮＤＶ）反應,，檢測靈敏度達到２０ＥＩＤ５０，組成的檢測器對相應的流感病毒響應良好,，該法與雞胚病毒分離法檢出流感病毒的符合率達到９１％,。林向華等（２００９）以ＡＴ切型、基頻１０ＭＨｚ的石英晶體為材料,，設計四通道芯片微陣列,。采用聚乙烯亞胺黏附—戊二醛交聯法
將禽流感Ｈ５、Ｈ９亞型單克隆抗體固定在石英晶體的金膜電極表面制備生物敏感膜,，構建可用于同步檢測禽流感Ｈ５,、Ｈ９亞型的壓電免疫芯片。構建的壓電免疫芯片用于檢測Ｈ５,、Ｈ９亞型抗原和疑似樣品,，其各自的響應值與空白對照的噪聲值之比均大于２，試驗構建的壓電免疫芯片可用于禽流感Ｈ５,、Ｈ９亞型的定性檢測,。
２．２ 蛋白質芯片技術
蛋白質芯片技術是一種高通量、高靈敏度,、自動化的蛋白質分析技術,，在蛋白質組的功能研究,、疾病診斷及藥物開發(fā)中顯示出巨
大的應用潛力（Ｓａｎｇ等，２００８）,。石霖等（２００９）制備了可以同時鑒別診斷禽流感（ＡＩ）,、新城疫（ＮＤ）２種
禽病血清抗體的可視化蛋白質芯片，將芯片與待檢血清雜交后,，再與膠體金標記的二抗雜交,，銀染顯色后根據灰度值判定結果，該可視化蛋白質芯片具有很好的特異性,，?Z?X暅 并且檢測靈敏度是瓊脂糖凝膠擴散（ＡＧＰ）方法的４００倍以上,。研究結果表明，該方法可用于同步鑒別兩種禽病,，是一種有效的抗體檢測新方法,。該技術不僅保留了抗原—抗體反應快速、靈敏和特異性的特點,，還可以滿足生物樣本多指標分析的需要,，因此更利于大規(guī)模推廣應用（Ｓｍｉｔｈ等，２００６）,。
２．３ 膠體金免疫層析法
陳洪等（２００７）用膠體金顆粒標記Ｈ５ 亞型禽流感病毒單克隆抗體Ａ（Ｂ５Ｃ７）,，用羊抗鼠ＩｇＧ和Ｈ５亞型禽流感病毒單克隆抗體Ｂ（３Ｃ４）噴涂于硝酸纖維膜質控線和檢測線上，研制出Ｈ５亞型禽流感病毒抗原金標快速診斷試紙條,。用禽流感Ｈ
５,、Ｈ９標準抗原和新城疫標準抗原作為檢測抗原對研制的試紙條進行特異性、敏感性和穩(wěn)定性試驗,，試驗結果表明該方法操作簡單,、靈敏度高、特異性強,、穩(wěn)定性好,，具有良好的應用前景。單抗介導的斑點免疫金滲濾法（ＤＩＧＦＡ）是利用Ａ型禽流感單克隆抗體和膠體金標記技術建立的快速檢測ＡＩＶ方法,。敏感性高于ＨＡ診斷方法,，２０～３０ｍｉｎ即可出結果，ＤＩＧＦＡ 具有不需試驗設備,、可用肉眼判定,、方法簡便、試劑用量少,、對人體無害等優(yōu)點（雷彩俠,，２００７）。
２．４ 熒光抗體試驗
免疫熒光技術（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ,，ＩＦＡ）是利用被標記上熒光色素的抗原（或抗體）特異性地與抗體（或抗原）結合,，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應來進行觀察的檢測方法,。最早用于鑒定ＡＩＶ 的ＮＰ和ＭＰ抗原，１９６１年開始用于人類流感的快速診斷,。秦愛建等（２００３）研制了抗禽流感Ｈ５和Ｈ９亞型病毒的單克隆抗體，建立了免疫熒光方法檢測ＡＩＶ,，可以檢測出相應的Ｈ５亞型病毒,。建立在單克隆抗體基礎上的免疫熒光方法具有快速、簡便,、易行,、較敏感等特點，也常用于臨床診斷,，但出現假陽性的幾率較高,。
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